去分化联合IDO基因修饰增强人脐带间充质干细胞的抗氧化应激存活及Treg细胞诱导能力

匡梅娜，黄思瑞，鲁 欣，周 畅，胡耀华，唐震林，袁 茵

（1.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州510006；2.华南师范大学生命科学学院，广东广州510631）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一类组织来源广泛的多能干细胞［1］，不仅可发生多向分化，还具有独特的免疫调节功能，能够在特定条件下抑制T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的体内外活化和增殖［2］，已被用于多种免疫相关疾病，如：难治性急性移植物抗宿主病的治疗［3］。此外，MSC的免疫原性低［4］、易于接受外源基因修饰［5］，并具有靶向迁移到肿瘤组织、损伤组织以及慢性炎性反应部位的特性［6］，因此可被用作肿瘤等基因治疗的载体细胞。然而，在进行体内移植时，外源输入的MSC在氧化应激［7］和组织缺血、缺氧［8］等恶劣环境下会大量死亡，疗效受到限制；另一方面，MSC的免疫调节能力对炎性因子的刺激有依赖性，只有在受到γ-干扰素等刺激并诱导性地表达吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）等效应分子后，MSC的免疫抑制活性才能表现出来［9］。因此，体内存活能力低下和依赖炎性因子刺激而活化的固有属性，是影响MSC疗效及临床适用范围的两个重要因素。有研究发现，去分化（dedifferentiation）预处理能够提高脂肪来源MSC的体内生存率［10］，而骨髓MSC在发生成神经去分化后也获得了更强的抗氧化应激生存能力［11］。脐带被认为是MSC的理想来源，但目前尚无关于人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hMSC）去分化特性的报道，对于去分化MSC基因修饰方面的研究亦不多见。我们在前期研究中发现，IDO基因修饰可显著增强hMSC的体外免疫抑制能力，且不影响其免疫表型、增殖能力和细胞活力［12］。基于上述发现，我们提出通过去分化联合IDO基因修饰的预处理手段，同时提高MSC的抗氧化应激能力和免疫抑制能力的研究设想，并开展了相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

脐带取自2017年3月于暨南大学附属第一医院顺产分娩的健康足月新生儿，产妇无传染性疾病。本研究已经通过学校医学伦理委员会审批，并经产妇本人知情同意。

DMEM/F12培养基、DMEM培养基、胰酶、青/链霉素溶液、脂质体LipofectamineTM2000为美国Gibco公司产品。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自浙江天杭生物科技有限公司。人淋巴细胞分离液为天津灏洋生物制品科技有限公司产品。共表达人IDO基因（IDO1；GenBank accession number AY221100）和ZsGreen1报告基因的重组逆转录病毒、ZsGreen1空载逆转录病毒由本室包装构建。质粒抽提试剂盒、PCR清洁试剂盒、胶回收试剂盒为Axygen公司产品。PE标记小鼠抗人CD45、PE/Cy5标记小鼠抗人CD34、FITC标记小鼠抗人CD4、PE/Cy5标记小鼠抗人CD25、PE标记小鼠抗人CD127流式抗体为美国Beckman Coulter公司产品；FITC标记小鼠抗人CD73、FITC标记小鼠抗人CD90、PE标记小鼠抗人CD105流式抗体为美国eBioscience公司产品。叔丁基过氧化氢（Tertbutyl hydroperoxide，t-BHP）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。人脐带MSC成脂和成骨诱导分化试剂盒购自赛业生物科技有限公司。细胞凋亡检测试剂盒为碧云天生物科技有限公司产品。

1.2 细胞培养

按本室已建立方法［12-13］分离hMSC，培养于DMEM/F12完全培养基（含100 mL/L FBS、10 mL/L青/链霉素）中，取P2～P5代细胞用于实验。病毒包装细胞株PA317由本室保存，培养于含100 mL/L FBS的DMEM培养基中。以上细胞均于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度的培养箱中贴壁生长，3～4 d传代一次。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分离自健康成年人外周血，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离。

1.3 去分化hMSC的诱导

将hMSC接种于10 cm细胞培养皿，加入DMEM/F12完全培养基培养至细胞汇合度达100%，更换成脂分化培养基诱导48 h，细胞形态发生变化，然后吸走诱导培养基，加入PBS洗涤细胞3次，重新加入DMEM/F12完全培养基继续培养48 h。当细胞重新回复为未分化时的形态时，进行第1次传代，即得到P0代去分化hMSC（DehMSC），之后每3～4 d换液1次，正常传代，取P0或P1代De-hMSC进行实验。

1.4 IDO基因修饰型De-hMSC的制备

De-hMSC感染前换液，培养体积减半，分3组进行感染：对照组De-hMSC正常培养，Mock/DehMSC组加入仅含有ZsGreen1报告基因的空载病毒（MOI=100），IDO/De-hMSC组加入共表达IDO和ZsGreen1的重组病毒（MOI=100）。接种病毒24 h后换液，加入DMEM/F12完全培养基继续培养48 h，观察绿色荧光蛋白报告基因ZsGreen1的胞内表达情况，并通过Western blot检测各组细胞的IDO蛋白表达情况。

1.5 IDO基因修饰型De-hMSC的鉴定

通过流式细胞术检测IDO/De-hMSC的免疫表型：消化收集细胞，制成密度为1×106个/mL的单细胞悬液，用PBS洗涤1次，分装至流式检测管（每管100 μL），分别加入荧光标记抗体CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD45-PE、CD34-PE/Cy5，并设同型对照和空白对照，室温避光孵育30 min，洗涤2次，最后用500 μL PBS重悬细胞，上BECKMAN COULTER Gallios流式细胞仪检测细胞表面标记，使用FlowJo软件处理结果。检测IDO/De-hMSC的成骨和成脂分化能力时，先将待测细胞在6孔板中培养至90%以上汇合，然后更换成骨或成脂分化诱导液继续培养，每周换液2次，诱导2～3周后，吸走诱导液，加入体积分数为10%的甲醛溶液固定30 min，分别加入茜素红染色液或油红O染色液进行染色，镜检。

1.6 细胞凋亡检测

取对数生长期的hMSC、De-hMSC、Mock/DehMSC和IDO/De-hMSC接种至6孔板，每种细胞均按如下分组进行实验：①对照组：置DMEM/F12完全培养基中培养；②t-BHP损伤组：在对照组基础上加入终浓度为300 μmol/L的t-BHP作用24 h。作用结束后，用不含EDTA的胰酶消化细胞，每组取 1×105个细胞，用PBS洗涤 1次，用85 μL试剂盒中的结合缓冲液重悬，再加入10 μL异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V（Annexin V-FITC）和（或）5 μL碘化丙啶（PI），轻轻混匀后室温避光孵育15 min，最后加400 μL结合缓冲液，上流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况，使用FlowJo软件处理结果。

1.7 Treg细胞含量测定

分别用含有不同MSC培养上清的条件培养基（conditioned medium，CM）培养PBMC，之后通过流式细胞术检测各组PBMC中Treg细胞的含量。首先分 4组（hMSC、De-hMSC、Mock/De-hMSC、IDO/De-hMSC）收集100%汇合时的细胞培养上清，0.22 μm滤膜过滤，-80℃冻存备用。用于培养PBMC时，取各组上清分别与DMEM/F12完全培养基按3∶2的体积比混合，即得到新鲜配制的条件培养基［14］，同时加入1 000 U/mL重组人IL-2和50 ng/mL OKT3对PBMC进行刺激。作用5 d后离心收集各组PBMC，加入PBS洗涤1次，分装至流式管，设空白对照、同型对照、单色荧光补偿对照以及三色荧光标记的待测样本，加入对应的荧光标记抗体（CD4-FITC、CD25-PE/Cy5、CD127-PE等），室温避光孵育30 min，洗涤2次，最后用500 μL PBS重悬细胞，上机检测CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的含量，使用FlowJo软件分析检测结果。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 De-hMSC诱导过程中的细胞形态变化

加入成脂分化诱导培养基诱导48 h后，hMSC的胞体发生明显变化，由长梭形转变为圆形或椭圆形。撤除分化诱导培养基并更换为干细胞培养基继续培养48 h后，已出现成脂细胞形态特征的hMSC重新恢复未分化时的细胞形态（图1）。

2.2 De-hMSC的基因修饰及干细胞特征鉴定

图1 De-hMSC诱导过程中的细胞形态图Fig.1 Photomicrograph of cell morphology during the induction of De-hMSC

接种IDO基因重组逆转录病毒48 h后，DehMSC胞内可见报告基因ZsGreen1大量表达（图2A），提示细胞已被病毒成功感染。Western blot检测显示，IDO重组病毒感染组De-hMSC的IDO蛋白表达呈阳性（图2B），进一步证实De-hMSC已被IDO基因成功修饰。IDO/De-hMSC仍具有体外分化能力，经诱导能够向成骨和成脂方向分化，茜素红染色和油红O染色分别呈阳性（图2C）。流式检测结果显示，IDO/De-hMSC表达CD90、CD73、CD105，不表达CD45和CD34（图2D）。

图2 IDO基因修饰型De-hMSC的鉴定Fig.2 Characterization of De-hMSC modified by IDO gene

2.3 去分化及IDO基因修饰对hMSC抗氧化应激存活能力的影响

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示：正常培养时，hMSC、De-hMSC、Mock/De-hMSC及IDO/De-hMSC的细胞存活率分别为（93.5±2.7）%、（93.9±0.7）%、（92.9±2.2）%、（95.1±1.7）%；300 μmol/L t-BHP作用 24 h后，hMSC、De-hMSC、Mock/DehMSC及IDO/De-hMSC的细胞存活率分别下降至（36.0±14.2）%、（83.3±3.5）%、（79.1±4.1）%、（79.0±7.2）%；以细胞存活率（%）为应变量，将细胞修饰方式（未修饰、去分化、去分化并转染空载病毒、去分化并转染IDO重组病毒）和细胞培养条件（正常培养和t-BHP处理）作为两个因素，经Two-Way ANOVA分析可知，细胞修饰方式分组与细胞培养条件分组的效应差异均有统计学意义（F=20.57，P＜0.0001；F=96.98，P＜0.0001），且两分组之间存在交互（F=19.74，P＜0.0001），提示细胞修饰方式及细胞培养条件两个因素协同作用于细胞存活能力。进一步采用Holm-Sidak′s分析，如图3所示，300 μmol/L t-BHP明显抑制hMSC存活，其细胞存活率与对照组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）；300 μmol/L t-BHP 作用组De-hMSC、Mock/De-hMSC和IDO/De-hMSC的细胞存活率出现下降，但与对照组间的差异均无统计学意义（P＞0.05），而与300 μmol/L t-BHP作用组hMSC之间的差异均有统计学意义（P＜0.05；图3）。

2.4 IDO/De-hMSC条件培养基对正常人淋巴细胞Treg亚群比例的影响

三色荧光标记流式细胞术检测结果显示，对照组PBMC（in DMEM/F12）的CD4+CD25+CD127lowTreg细胞含量为（5.6±0.2）%，4种条件培养基处理组PBMC的Treg细胞含量均较对照组升高，其中IDO/De-hMSC-CM处理组的Treg细胞比例为（20.9±2.1）%，上调幅度最大，与其它各组间的差异均有统计学意义（P＜0.05）；hMSC-CM、De-hMSCCM、Mock/De-hMSC-CM处理组的Treg细胞含量分别为（8.7±0.5）%、（8.2±0.4）%、（7.5±0.2）%，与对照组间的差异无统计学意义（P＞0.05；图4）。

图3 去分化和IDO基因修饰对hMSCs抗氧化应激生存能力的影响Fig.3 The effects of dedifferentiation and IDO gene modification on the survival ability of hMSCs against oxidative stress

图4 IDO基因修饰和去分化对hMSC诱导Treg细胞能力的影响Fig.4 The effect of IDO gene modification and dedifferentiation on the ability of hMSCs to induce Treg cells

3 讨论

在特定诱导条件下，MSC可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、神经、心肌等多种组织细胞。不仅如此，已分化的MSC还具有重新回复为原始未分化MSC的能力，即：去分化能力。去分化又称脱分

化，指已分化的细胞失去其特有的结构和功能，从不分裂的静止状态变化到活跃的分裂状态、重新具有原始未分化细胞特性的过程［15］。去分化也是MSC的多向分化潜能特点之一。在改变MSC的诱导培养条件后，MSC能够从已分化的形态回复到未分化时的原始MSC形态，并可转分化为其它类型的细胞［16-17］。Liu等［11］发现，MSC源的神经细胞在撤除神经元诱导因子后发生去分化，重新回复到MSC样状态，与未分化的MSC相比，抗凋亡相关基因和神经细胞相关基因表达增多、生存期延长。张慧等［17］证实，MSC源的成骨细胞在撤除成骨诱导因子后亦可回复为MSC样状态，且体外再次成骨分化效率明显高于原始MSC。本文的研究也表明，已发生成脂分化的人脐带MSC在撤除诱导因素后，仍能回复到未分化时的初始形态。

体内外的氧化应激环境可诱导MSC的凋亡或大量流失，是限制MSC疗效发挥的主要因素之一［7］。为模拟氧化应激对MSC的损伤，我们建立了t-BHP诱导细胞凋亡的细胞模型，并比较了hMSC和De-hMSC在氧化应激条件下生存能力的差异。我们发现，去分化预处理能够提高hMSC在氧化应激条件下的抗凋亡能力，有望克服未分化MSC移植到体内后存活率低下的缺点［8］。

IDO是MSC在受到炎性细胞因子刺激后所表达的一种重要的免疫抑制效应分子，对MSC免疫抑制能力的发挥有直接的决定作用。但静止状态的MSC并不表达IDO，只有在γ-干扰素的高强度刺激下，MSC才会诱导性地表达IDO，进而发挥其免疫抑制作用，这一现象在骨髓和脐带来源的MSC中都已得到了证实［9，18］。鉴于IDO在MSC免疫抑制效应中的重要地位，为进一步评价De-hMSC作为载体细胞用于免疫相关疾病基因治疗的能力，我们进行了De-hMSC的IDO基因修饰和免疫调节功能研究。我们发现，去分化联合IDO基因修饰，不影响hMSC的细胞形态、免疫表型及成脂、成骨分化能力；在功能上，这种经过“双重”改造的hMSC，不仅抗氧化应激生存能力提高，并且对Treg细胞产生了一种更为显著的接触非依赖性诱导作用。

Treg细胞是机体发挥免疫抑制功能的关键性调节细胞，在体内的主要作用是调节机体免疫平衡，防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应的发生［19］。我们的前期研究证实，用含有hMSC培养上清的条件培养基处理PBMC，能够上调其所含CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的含量，同时下调CD4+/CD8+T细胞的比值，但对其它淋巴细胞亚群的含量无显著影响［20］。因此，在本研究中我们重点分析了IDO/De-hMSC对Treg细胞的影响。我们发现，去分化hMSC对Treg细胞也有一定的诱导作用，而IDO基因修饰则使这种诱导作用发生了进一步的增强。与本研究类似，有报道指出，过表达IDO基因的大鼠骨髓MSC对淋巴细胞中的Treg细胞有明显的促进作用［21］；He等［22］研究发现，IDO基因转染MSC与PBMC共培养，可以明显促进CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖。已知IDO是催化色氨酸降解代谢初始步骤的限速酶，而色氨酸是效应性T淋巴细胞等维持增殖和活性的必需氨基酸，因此IDO的活性表达会对多种免疫细胞的活化、增殖产生直接的抑制作用。上述研究结果则提示，除了直接抑制免疫细胞的增殖外，IDO还可通过诱导Treg细胞来间接发挥免疫抑制作用。

综上，成脂去分化联合IDO基因修饰能够在保留hMSC基本功能的基础上，增强hMSC抗氧化应激生存能力及其对Treg细胞的诱导能力。上述研究结果加深了我们对MSC去分化以及IDO免疫抑制机制的认识，为MSC移植治疗中细胞活力、免疫抑制疗效等方面存在的问题提供了可借鉴的解决方案。下一步我们将利用适当的动物模型进行IDO基因修饰型去分化MSC的体内功能研究，以期为修饰型MSC在临床免疫治疗中的应用提供更为全面可靠的参考。