三七花醇提物PNFM对健康人血小板功能的体外作用

覃 楠，李 卿，左 晓，邹培斧，马丽娟，万建波，杨 燕3，4，，7，嘉红云

（1.广州医科大学附属第二医院检验科，广东广州510260；2.中山大学公共卫生学院营养系，广东广州510080；3.广东省营养与健康重点实验室，广东广州510080；4.广东省营养转化工程技术研究中心，广东广州510080；5.中山大学公共卫生学院（深圳），广东深圳518000；6.澳门大学中药质量研究国家重点实验室，澳门；7.深圳市大鹏新区妇幼保健院保健部，广东深圳518120）

血栓性疾病主要是指动脉血栓习惯疾病和静脉血栓性疾病，主要包括心肌梗死［1-2］、脑血栓［3-4］和深静脉血栓，发病率很高，已成为我国与西方国家人口死亡和致残的主要原因［5］。血栓形成或栓塞是导致心、脑和外周血管事件的最后关键环节，是致死和致残的直接原因。血小板在血栓形成特别是动脉血栓和微血管血栓形成中起着关键作用［6］，其中血小板异常活化、聚集等并启动血栓形成的过程尤为关键，有效抑制血小板过度活化是防治动脉血栓的主要方法之一。目前临床应用的抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷等，均存在出血、胃肠道反应等副作用，因而寻找临床疗效显著且不良反应小的抗血小板药物是近年来关注的热点［7］。三七为五加科人参属植物，是我国传统中药材，安全性高且疗效显著，已被用于预防和治疗多种疾病。三七的根、茎、叶、花均可入药，其中主要活性成分为三七皂苷，目前三七根中提取的三七总皂苷被研究可抗炎、抗血小板、改善血栓［8-9］而在临床上被广泛应用于心脑血管疾病的治疗，其主要的作用成分为一些二醇皂苷和三醇皂苷［10］；三七花作为民间药物或膳食补充，过去也常用于预防心血管疾病等，已被证实具有多种药理活性，包括抗癌［11］、抗菌［12］、抗氧化［13］及改善急性心肌梗死的预后等等，且三七花朵部分的皂苷含量是最高的［14］，与三七根部有明显的差异，但目前尚未发现关于三七花的皂苷对健康人血小板及血栓影响的相关报道。因此，本课题从三七花朵的粉剂提取出溶于甲醇的皂苷，获得三七花的醇提取物（Panax Notoginseng flower extracted by methanol，PNFM）。本研究在体外实验中探讨PNFM对健康人血小板活化、释放、黏附及钙离子动员和聚集等功能的影响，为三七花应用于心脑血管血栓疾病的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

招募健康大学生志愿者，纳入标准包括：①至少2周内未服用过任何抗凝或抗血小板药物；②未摄入过三七、人参等富含三七皂苷的物质；③无吸烟、酗酒等习惯。所有志愿者均对实验方法知情且已签署知情同意书，本实验通过中山大学公共卫生学院伦理委员会审核同意。

1.2 药物及试剂

1.2.1 试剂及仪器 FITC Mouse Anti-Human CD62P、FITC Mouse Anti-Human PAC-1、IgG 购自BD Pharmingen公司；ATP标准品及荧光试剂盒购自Chrono-Log公司；Phalloidin-iFluor 488购自Abcam公司；血小板聚集仪购自Chrono-Log公司；Gallios流式细胞仪购自Beckman公司；酶标仪购自Bio-Tek instrument Inc。

1.2.2 提取物准备 三七花醇提物PNFM由中药质量研究国家重点实验室（澳门大学）提供。具体提取方法为：将约200 mg的PNF细粉放入于10 mL的甲醇中，混匀20 s。于室温下将此悬浮液置于超声浴中超声提取2 h后，取上清装入25 mL容量瓶中，用甲醇定容后，用0.22 μm过滤器进行过滤，再将20 mL的上述液体于65℃的旋转真空蒸发器中浓缩至干燥后，将其溶于3 mL去离子水中，再用真空冷冻干燥器冷冻干燥，得到PNFM冻干粉，将其溶于蒸馏水调整浓度为50 mg/mL用于体外研究［15］。

1.3 富血小板血浆及纯化血小板的制备

采用静脉穿刺抽取健康志愿者外周静脉血15 mL于柠檬酸钠抗凝管中。将采集的全血以1 000 r/min的转速（r=8.5 cm，下同）室温离心10 min，上清转移至新的EP管中，得到富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）。剩余血液以3 000 r/min离心15 min，收集上清得到贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）。再将PRP于SepharoseCL-2B凝胶过滤系统过滤后得到纯化血小板。

1.4 血小板P-选择素和PAC-1的流式细胞术检测

将PRP用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）稀释至1×106/mL，分别取50 μL的血小板与不同浓度 PNFM（0、100、300、500 μg/mL）孵育20 min，分别与FITC-CD62P、FITC-PAC-1避光37℃孵育30 min后，加入终浓度为100 μmol/L的ADP激活5 min，然后立即加入10 g/L的多聚甲醛溶液避光固定，上机检测［16］。

1.5 血小板ATP释放实验

取230 μL PRP，加入20 μL ATP荧光试剂，测定终质量浓度2 ng/mL的ATP标准品的最大峰值；取与不同浓度PNFM孵育后的PRP，加入20 μL ATP荧光试剂后，分别测定5、10 μmol/L ADP诱导的各组孵育后的血小板的最大ATP释放量，7 min后终止反应，软件自动计算得到ATP释放浓度，记录释放曲线［16］。

1.6 血小板在纤维蛋白原上的铺展实验

在玻片上铺展纤维蛋白原（终质量浓度为100 μg/mL）4℃过夜后，BSA（PBS配制）封闭，然后分别加入预先干预好的纯化血小板（浓度1×107/mL）和1 mmol/L的CaCl2，37℃铺展1 h，PBS洗净后加入40 g/L的多聚甲醛溶液固定15 min，再用0.1%Triton X-100穿孔后，用Phalloidin-iFluor 488进行荧光染色1 h，防淬灭剂封片后，激光共聚焦显微镜下观察拍照，用ImageJ软件计算血小板铺展面积。

1.7 血小板聚集实验

取250 μL PRP与不同浓度的PNFM孵育20 min，分别用5、10 μmol/L 的ADP作为诱导剂后用血小板聚集仪检测样本的最大聚集率，8 min后终止反应，记录聚集曲线［16］。

1.8 统计学分析

所有的数据统计分析均采用SPSS 20.0软件进行。多组计量资料采用单因素方差分析（ANOVA），多组比较有统计学意义后采用Dunnett′st检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PNFM在体外对健康人血小板CD62P的影响

在100、200 μmol/L的ADP诱导下，PNFM干预组的血小板表面CD62P的表达量均比对照组显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图1）。

2.2 PNFM在体外对健康人血小板PAC-1的影响

在100、200 μmol/L的ADP诱导下，PNFM干预组的血小板表面PAC-1的表达量均比对照组显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

2.3 PNFM在体外对健康人血小板ATP释放的影响

在5 μmol/L ADP的诱导下，PNFM干预组对健康人血小板的ATP的释放均有显著抑制作用，与对照组相比，差异具有统计学差异（P＜0.05，图3）。

图1 PNFM抑制ADP诱导的健康人血小板CD62P的表达Fig.1 PNFM inhibited the expression of CD62P of healthy human induced by ADP

图2 PNFM抑制ADP诱导的健康人血小板PAC-1的表达Fig.2 Effect of PNFM on human platelet αIIbβ3 activation induced by ADP

图3 PNFM抑制ADP诱导的健康人血小板ATP的释放Fig.3 PNFM inhibited the ATP release of healthy human induced by ADP

图4 PNFM抑制健康人血小板在纤维蛋白原上的铺展Fig.4 PNFM inhibited healthy human platelet spreading on fibrinogen

2.4 PNFM对健康人体外血小板在纤维蛋白原上铺展的影响

与对照组相比，PNFM的各浓度干预组的单个血小板面积均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，图4）。

2.5 PNFM在体外对健康人血小板聚集的影响

在5、10 μmol/L的ADP的诱导下，PNFM 300、500 μg/mL的干预组明显抑制健康人体外血小板的聚集，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

2.6 PNFM在体外对健康人血小板钙离子动员的影响

在200 μmol/L的ADP的诱导下，PNFM所有干预组明显抑制健康人体外血小板钙离子的动员，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05，图6）。

图5 PNFM抑制ADP诱导的健康人血小板的聚集Fig.5 PNFM inhibited the platelet aggregation rate of healthy human was induced by ADP

图6 PNFM抑制ADP诱导的健康人血小板的钙离子动员Fig.6 PNFM inhibited the platelet calcium mobilization of healthy human induced by ADP

3 讨论

血小板过度活化、聚集在血栓的发生发展中发挥重要作用，抑制血小板过度活化和聚集等功能已经成为防治血栓性疾病的重要靶标之一。三七对血小板的研究大多基于三七根部，但其不同部位如花朵部分与三七根部的皂苷成分含量有很大的不同［17］，如三七花中含有丰富的人参二醇皂苷Fc和Rc、Rb2、Rb3，这些在三七根中含量极少。过去由于技术局限性，三七根部较花朵更易获取和保存，因此主要使用三七根部作为活血化瘀中药的主要成分。但最近研究指出，三七花中皂苷含量更为丰富，可能具有更高的药用价值。它们对血小板功能的影响研究极少，其中含量较多的Rb3、Rc、Rb2被报道有抗炎，抗氧化，调节脂质代谢等功能［18-20］，尚无对血小板的相关研究，在花朵中含量少而根部含量较高的Rb1被证明对SD大鼠的血小板聚集有抑制作用［21］，但其对人血小板功能的研究尚无报道。本研究使用的PNFM主要含有Rb3、Rc、Rb2、Rb1、Rd、Fc等几种皂苷，已被证明有抗炎的作用［15］，我们用它干预人血小板，探索三七花中皂苷对血小板功能的影响。研究结果显示，PNFM可以显著抑制不同浓度的ADP诱导的血小板活化、释放、黏附，聚集及钙离子动员。血小板无核，但含有丰富的颗粒物包括α颗粒、致密颗粒、溶酶体等，它们对血小板功能有至关重要的作用。血小板颗粒释放引起大量的活性分子在血管损伤部位的聚集，这些活性物质具有多种生物学活性，包括放大细胞活化信号，启动血栓的形成，介导细胞的黏附，促使细胞分化和迁移。已有研究显示，降低血小板颗粒释放水平，可以抑制膳食诱导的动脉血栓，动脉粥样硬化的形成，炎症反应等［22-23］。本研究结果，PNFM可以显著调节人血小板功能，尤其对血小板颗粒物释放作用如α颗粒的CD62P、致密颗粒的ATP释放的效果特别显著。血小板中颗粒物释放的信号通路很复杂，如3羧基磷脂酰肌醇激酶PI3K是血小板活化过程中的关键信号传导分子，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt是其下游的主要效应分子；是多种激活剂活化血小板的共同通路［24］，Akt可以通过活化内皮型一氧化氮合成酶eNOS促进血小板NO生成，刺激cGMP产生，从而调控血小板颗粒释放［25］；丝裂原活化蛋白激酶家族MAPKs中的P38、ERK等在血小板中均有表达，也参与调控血小板颗粒物释放等多种功能［26］。PNFM通过哪些信号通路来实现其效果，我们进行了以下猜测：PNFM中含量最高的皂苷Rb3可以通过Pyk2-PI3K-AKT信号传导途径抑制柯萨奇病毒B3感染后的心脏微血管内皮细胞的内皮-间质转化［18］；含量较高的Rc被证明可通过p38/ATF-2信号传导而发挥抗炎作用［27］，还可调节Akt/FoxO1而抑制人胚胎细胞的氧化应激；同样含有Rb1的三七总皂苷曾被报道抑制血小板活化和聚集与血小板中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）蛋白的过表达，和PI3K/Akt/eNOS途径的上调有关［28］。其中Rb1还被报道可以通过抑制PI3K/Akt途径从而抑制血管内皮功能紊乱和保护心肌缺血再灌注［6］。因此我们推测PNFM是否可能通过这些通路从而影响血小板颗粒物释放等功能，目前尚不清楚，需要我们进一步深入研究。

综上所述，PNFM可以有效抑制血小板过度活化和聚集等功能，为三七花作为防治心脑血管血栓性疾病的药物提供了新的可能。