过氧化物还原酶3参与肾透明细胞癌发生与发展的分子机制

郑丹琴，刘志磊，朱松杰，吕锦晶，章文韵，邓海腾，周 韧

（1.浙江大学医学院病理学与病理生理学系，浙江杭州310058；2.杭州市临安区人民医院病理科，浙江杭州311300；3.清华大学生命科学学院，北京100038）

肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是泌尿系统常见的一种高度异质性恶性肿瘤，是肾癌的主要类型（约80%）［1］。手术切除仍是目前较为常见的治疗手段［2］，但是肾透明细胞癌的特点是很容易转移，所以病人手术预后较差，死亡率较高［3］。目前缺乏ccRCC特异的肿瘤标志物，也缺少针对ccRCC的靶向药物。所以寻找ccRCC特异的肿瘤标志物，揭开肿瘤发生发展机制及找到相关的治疗靶点，仍是该领域的研究热点［4］。硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶3（thioredoxin-dependent peroxide reductase 3，PRDX3）是存在于线粒体中的过氧化物还原酶，线粒体DNA对于代谢产生的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）更敏感，也更容易受到损伤。PRDX3能清除线粒体中90%的过氧化氢。目前已发现PRDX3在肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌等癌组织中高表达［5-8］，而在膀胱癌、肾癌、胰腺癌组织中下调表达［9］。PRDX3在不同的类型的肿瘤组织中表达量差异的原因，有待通过进一步研究揭示。本研究收集16例ccRCC癌及癌旁组织样本，发现其中14例ccRCC癌组织中PRDX3的表达量显著低于癌旁正常组织。推测PRDX3可能参与了肾透明细胞癌的发生发展过程，并且肾透明细胞癌中PRDX3的表达可能受到了抑制。本研究在786-O人肾透明细胞癌细胞系中过表达了PRDX3基因，使其表达量与正常组织表达量一致，也构建了PRDX3敲低表达的细胞系。发现过表达PRDX3的细胞系细胞生长明显变慢；但敲低表达PRDX3后，两组细胞生长速率在统计学上无显著性差异。提示提高PRDX3的表达量可能在某种程度上抑制了肿瘤细胞的生长。肿瘤的发生发展是一个多基因、多因素且多阶段的复杂过程。PRDX3参与肿瘤的发生发展过程，可能是与其他蛋白共同作用实现。本研究pull-down了与PRDX3相互作用的蛋白，发现过氧化物酶 1（peroxiredoxin 1，PRDX1）通过二硫键与PRDX3相互作用。推测二者相互作用可能共同影响了肿瘤细胞的生长。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PRDX3抗体购自Abcam公司，兔源二抗购自Cell Signaling Technology公司；内参β-ɑctin抗体购自Abmart公司；人786-O细胞系、慢病毒质粒等来自本实验室保藏；使用RPMI1640培养基购自Wisent公司、胎牛血清FBS购自四季青公司，双抗青霉素/链霉素购自Sigma公司；CCK-8试剂购自Dojindo公司；抗flag beads购自sigma公司；qPCR试剂购自Vazyme公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；点突变试剂盒购自天根公司。

1.2 实验仪器

Q Exactive质谱仪（Thermofisher），荧光定量PCR仪（LC480，Roche），流式细胞分析仪（BD Calibur）。

1.3 样本收集

收集2015年5月至2016年3月期间在我院进行肾切除术后的组织样本，术后病理结果证实为肾透明细胞癌的肾癌。癌和癌旁组织用PBS缓冲液冲洗后，一部分组织冻存于液氮中，另一部分用甲醛固定后用于免疫组化染色。患者术前均未经过放疗和化疗，本研究收集16例肾透明细胞癌及癌旁组织样本，患者年龄为48～72岁，其中男性9例，女性7例。本项研究标本的收集均经本院伦理委员会的认可，并经患者同意。

1.4 细胞培养与稳定表达细胞系构建

1640培养基中培养人786-O细胞，将携带有PRDX3基因的质粒和三种辅助质粒，通过慢病毒感染的方式，转入786-O细胞，使PRDX3基因插入细胞基因组中。用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞，挑选单克隆，接种96孔板，两周内荧光显微镜观察，并将阳性克隆转移至6孔板扩大培养，根据表达量挑选合适的PRDX3过表达稳定细胞株。同时构建空载质粒的细胞系，标记为786O-PRDX3（+）和786O-PRDX3（-）。同理，根据GenBank中PRDX3的mRNA序列设计发卡结构和选取无意义shRNA序列（表1），构建PRDX3敲低表达细胞系和对照细胞系，标记为786O-PRDX3KN和786OPRDX3NCi。

表1 PRDX3及阴性对照的shRNA序列Table 1 shRNA sequence of PRDX3 and control

1.5 过表达和敲低表达细胞系的验证

实时定量PCR和western blot验证PRDX3的表达情况。qPCR特异性引物和β-ɑctin内参引物见表 2（http：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/），提取786O-PRDX3（+）、786O-PRDX3（-）、786O-PRDX3KN、786O-PRDX3NCi和野生型细胞的总RNA，逆转录成cDNA，配制qPCR反应体系，用Light Cycler®480 II（Roche）进行实时荧光定量检测。每组实验的样品需同时做3个重复孔。

裂解上述五种细胞，取等量（10 μg）蛋白上样SDS-PAGE，采用半干转三明治夹心法将蛋白从SDS-PAGE胶转到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，用PRDX3抗体（1∶500）4 ℃ 孵育过夜，洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗，室温孵育1 h，再次洗膜，加入ECL显色液，用凝胶成像系统检测发光条带。肾透明细胞癌组织样品的western blot试验操作同上，上样量为20 μg。

1.6 细胞生长曲线测定（CCK-8法）

786O-PRDX3（+）、786O-PRDX3（-）、786OPRDX3KN、786O-PRDX3NCi和野生型5种细胞以每孔1 000个细胞量均匀铺96孔板，时间梯度设置为12、24、48、60、72、96、108 h，每个时间点每孔加入7 μL CCK-8试剂，450 nm处测定OD数值。每组设置3个重复孔和1个空白孔，本实验重复3次。以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

表2 PRDX3及β-actin的qPCR引物Table 2 qPCR primers of PRDX3 and β-actin

1.7 相互作用蛋白pull-down试验

重组PRDX3蛋白的C端融合有flag标签，用抗flag的beads进行pull-down，寻找与PRDX3相互作用的蛋白。上述五种细胞系裂解，BCA法测定蛋白浓度，按照5 mg总蛋白用40 μL beads的比例，等质量等体积与beads孵育，4℃过夜孵育。裂解液冲洗beads 3次后，加入等量的洗脱缓冲液，洗脱beads上吸附的蛋白。进行SDS-PAGE电泳或western blot检测。

将SDS-PAGE胶对应50 ku左右的条带切下，并进行脱色及酶切操作，用于二硫键鉴定的样品，全过程不使用DTT还原，质谱级胰蛋白酶溶液（50∶1）37℃酶切过夜。萃取出酶切后的肽段，浓缩后进行LC-MS/MS质谱分析。

1.8 质谱分析

Q Exactive质谱仪采用软件Xcalibur 2.1.2以data-dependent acquisition模式进行数据采集。Orbitrap中的全扫描范围为400～ 1 800 m/z（75，000分辨率）后，母离子经32%的HCD能量值碎裂后，进行20次二级MS/MS扫描。母离子选择的质量窗口为2.0 m/z。触发MS/MS的阈值为8.0×103。动态排除时间为20 s。质谱扫描产出的MS/MS谱图，通过使用Proteome Discoverer软件（version 2.0）搜索uniprot人数据库（version 20171220）。

1.9 二硫键分析

同2.4准备样品，SDS-PAGE胶、细胞裂解液、上样缓冲液均不含还原剂，样本处理方式分为与非变性上样缓冲液混合直接上样。运行SDSPAGE，切胶、酶切与质谱鉴定。pLink软件搜索自建数据库（PRDX1/PRDX3sequences）。

1.10 统计学分析

统计学分析采用SPSS软件（18.0）和Graph-Pad Prism 5软件分析，计量数据以均数±标准差（）表示。两组间数据比较采用t检验，生长曲线各时间点的组间比较采用多时间点重复测量的方差分析，本研究中试验均重复3次，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾透明细胞癌组织中PRDX3的表达验证

在收集的16例肾透明细胞癌组织与对应的癌旁组织中检测了PRDX3的表达情况。图1A为16例样本的western blot检测结果，图1B为灰度值统计结果，以癌旁组织表达量作为对照，进行归一化。16例肾癌样本中，有14例样品PRDX3下调表达，2例上调表达。其中差异1.35倍以上的有12例，下调均值为1.78倍。此外，本研究通过定量蛋白质组学的方法，对16例肾癌及癌旁样本进行了定量分析，其中PRDX3的表达与western blot结果基本一致，同样以下调1.35倍作为cutoff值，16例样本中有12例下调表达，下调均值为1.89倍（表3）。

图1 肿瘤组织样本中PRDX3的表达验证结果Fig.1 validation of PRDX3expression in tumor tissues

2.2 PRDX3过表达和敲低表达细胞系的验证

本研究在786-O细胞系中通过慢病毒表达载体感染细胞，筛选多株单克隆稳转细胞系，采用qPCR和western blot的方法验证了所挑选的单克隆细胞系中PRDX3的表达情况。根据表达量挑选1株单克隆稳转细胞系，使其表达量与组织水平差异表达倍数接近（1.78倍）。图2A、B为qPCR和western blot验证PRDX3在mRNA和蛋白水平的过表达情况，与786O-PRDX3（-）相比，786O-PRDX3（+）分别过表达约2.1倍和1.8倍。图2C、D为qPCR和western blot验证PRDX3在mRNA和蛋白水平的敲低表达情况，与786O-PRDX3NCi相比，786OPRDX3KN分别低表达约0.48倍和0.51倍。

表3 PRDX3的TMT定量蛋白质组学结果Table 3 the ratio results for PRDX3in quantitative proteomic based on TMT labeled

图2 PRDX3过表达和敲低表达细胞系的验证结果Fig.2 Verification for PRDX3 mRNA and protein expression in different cell lines

2.3 细胞生长速率检测

为了探究PRDX3的表达量对肾透明细胞癌细胞生长的影响，本研究对786O-PRDX3（+）、786OPRDX3（-）及野生型细胞系（WT）进行了生长曲线测定，绘制OD值与时间的生长曲线。786OPRDX3（+）与786O-PRDX3（-）细胞系相比，48 h后出现显著性差异，细胞生长速度显著减慢（P=0.001）。至120 h时，786O-PRDX3（+）组细胞较其他两组细胞下降了约30%（图3A）。

本研究也对786O-PRDX3-KN、786O-PRDX3-NCi及野生型细胞系（WT）进行了生长曲线测定。绘制OD值与时间的生长曲线。发现敲低PRDX3后，与阴性对照细胞相比，并无显著性差异（P=0.106；图3B）。

2.4 Pull-down相互作用蛋白

本研究构建的786O-PRDX3（+）稳转细胞系中融合了flag标签，采用Anti-flag tag的beads进行pull-down试验，用于与PRDX3相互作用蛋白的挑选。优先挑选与对照组相比，786O-PRDX3（+）组特有的蛋白。表4呈现的是得分排在前10位的蛋白，这些蛋白主要与氧化应激与蛋白降解途径有关。

2.5 PRDX3参与ccRCC发生发展机制的初步探索

研究表明，PRDX家族通过与其他蛋白形成二硫键来传递氧化信号［10］，推测PRDX3也是通过二硫键与其他蛋白相互作用的。本研究利用二硫苏糖醇DTT和加热条件能打开二硫键的原理进行探索分析，图4为786O-PRDX3（+）在还原/非还原条件下pull-down的结果，PRDX3主带所在位置在26 ku左右，PPI箭头处（48～63 ku之间）出现明显的特异性条带，推测可能是与PRDX3特异结合的相互作用蛋白。

2.6 PRDX1与PRDX3结合位点的初步确认

结合SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果，将图4箭头对应条带切下，胶条经脱色等处理后，进行胰蛋白酶酶切，进行质谱分析，通过pLink软件将质谱谱图与数据库进行比对。表4是基于pLink的肽段交联信息，PRDX3通过第229位半胱氨酸与PRDX1第173位半胱氨酸交联，score值0.0028，b、y例子匹配良好，交联位点可信。

2.7 验证PRDX1与PRDX3的结合位点

图3 生长曲线测定结果Fig.3 Cell proliferation rate detected by the CCK-8 assay in five cell lines

表4 基于质谱分析及数据库搜索的蛋白质鉴定信息Table 4 Protein identity information for protein interaction with PRDX3based on LC/MS-MS

本研究将PRDX3蛋白第229位的半胱氨酸C定点突变成丙氨酸A后，测序确认突变效果。通过lipo2000转染试剂，将突变前后的PRDX3过表达质粒分别采用瞬时转染的方式转入786-O细胞系中，48 h后裂解细胞分别进行pull-down试验。Western blot的结果表明，突变之后，不再能检测到PRDX1条带，而突变之前仍可以看到PRDX1条带（图5），证明两者是通过二硫键相互作用的。两者相互作用，可能共同参与了氧化还原过程，也可能由于与PRDX1相互作用，解除了对PRDX3的抑制，使相关胞内信号得以传递。

3 讨论

本研究首次发现PRDX3在肾透明细胞癌组织中显著下调表达，按照下调表达的平均倍数，在肾透明细胞癌786-O细胞系中过表达了PRDX3基因。过表达PRDX3基因的肿瘤细胞生长速度显著变慢，PRDX3的表达水平可能直接影响了肿瘤细胞的生长。通过pull-down实验和western blot试验证明PRDX1与PRDX3通过二硫键直接相互作用。PRDX3不但能调节胞内 ROS 水平［10］，而且还是c-Myc转录因子的下游靶标，参与细胞凋亡、肿瘤发生等过程［11］。两者的相互作用可能引起了ROS的变化，也可能介导了信号传递，进一步影响了肿瘤细胞的生长。

表4 基于pLink的肽段交联信息Table 4 cross-link analysis for PRDX3 and PRDX1 based on the pLink software

图4 在还原/非还原条件下pull-down的胶图Fig.4 The gel map of pull-down analysis by SDSPAGE in reduce and non-reduce condition

图5 Pull-down试验验证PRDX3与PRDX1的相互作用Fig.5 Site mutation for PRDX3for validating PRDX3-PRDX1interaction

PRDX3在多数的癌组织中上调表达，但在肾透明细胞癌中PRDX3下调表达，猜想在肾透明细胞癌中PRDX3的表达可能在某种程度上被抑制。Xi等［12］报道称低氧诱导因子1α（HIF1α）能够抑制PRDX3的表达，从而促进ccRCC细胞增殖。PRDX3作为线粒体主要参与氧化还原的蛋白，还能参与信号的调控。PRDX3表达减低，或许使某种信号不能传递。在我们的实验中，我们将PRDX3的表达量在原有基础上又下调了一倍，但并未观察到明显的细胞表型变化。PRDX3的这一水平表达，可能还不足以引起胞内信号的变化。是否PRDX3的表达量与信号传递有关系，我们将尝试对PRDX3进行基因敲除，继续探究。

肾透明细胞癌的发生发展是一个多基因参与的过程，目前已知在肿瘤的发生发展过程中，PRDX3与Nrf2、Abrin、Srx、FOXO3A等蛋白存在相互作用［13-16］，共同影响肿瘤细胞的生长，参与肿瘤的发生发展过程。本研究中首次发现PRDX3与PRDX1存在相互作用，也发现PRDX3通过二硫键形成了同源二聚体。PRDX3通过与PRDX1的互作以及自身形成的二聚体，是否解除了对PRDX3的抑制，介导信号传递，从而影响肿瘤细胞的生长，还需进一步研究证明。

肿瘤细胞过度增殖的特性之一就是胞内ROS增加，PRDX3的表达可明显调节胞内ROS水平［10］。ROS是一把双刃剑，过高或过低均不利于肿瘤细胞是生长。未来将进一步检测胞内ROS水平的变化，阐述PRDX3表达量与胞内ROS的关系，揭示PRDX3低表达与肾透明细胞癌细胞生长速率的关系。从蛋白表达水平来看，肾透明细胞癌中PRDX3下调表达，可与其他潜在的肿瘤标志物PBRM1［17］、ErbB3［18］、LHX2［19］等协同预警肾透明细胞癌。提高PRDX3的表达量，肿瘤细胞生长速率明显减慢，提示可以开发基于PRDX3的肾透明细胞癌靶向药物。