氮素水平对宽叶雀稗生理生态的影响

王文娟，赵丽丽,2，王普昶，陈 超，余青青，张宇君

（1. 贵州大学动物科学学院草业科学系，贵州 贵阳 550025；2. 国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心，贵州 贵阳 550001；3. 贵州省草业研究所，贵州 贵阳 550006）

氮素是植物生长发育的必要营养元素，能促进根、茎、叶生长，提高植物光合作用和生物量积累[1-2]。在适宜范围内，增加氮素用量可以提高植物生产性能[3]。研究发现，氮素的不足或过量会降低黑麦草(Lolium perenne)的光合作用，影响黑麦草的地上生物量积累[4]。高羊茅(Festuca arundinacea)在氮素水平较低时，其叶绿素含量下降，而过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加[5]。过低或过高氮浓度会导致植株体内活性氧和丙二醛等膜脂过氧化物加速累积，进而损伤细胞膜结构，降低光合作用，影响其正常生长[6]。而增加施氮量能够提高植物中叶绿素含量，促进植物的光合作用[7]。

宽叶雀稗(Paspalum wettsteinii)是一年生或多年生的禾本科牧草，在我国西南山区以适应性强、耐土壤瘠薄等特性成为栽培草地建植、水土保持和绿化的常用植物，显示出较好的生态、经济效益[8-9]。氮素水平对宽叶雀稗生物量的积累影响极大。目前，关于宽叶雀稗的研究主要集中在种子休眠特性、抗旱性、播种方法等方面[10-12]，而氮素对宽叶雀稗生理及光合特性的影响尚未见报道。为初步揭示宽叶雀稗对氮素的适应机制，探究适合宽叶雀稗生长的氮素水平，本研究对不同氮素水平下宽叶雀稗生长的生理指标及光合特性进行动态分析，以期通过生长、生理、光合的变化，为宽叶雀稗的高效栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

宽叶雀稗种子由贵州省草业研究所提供。

选择颗粒饱满、大小均匀的宽叶雀稗种子，采用纸上发芽法，于25 ℃的恒温培养箱中进行萌发和幼苗培养。培养5周后，选择三叶一心的幼苗进行砂培。砂培基质是1～2 mm石英砂，提前用稀盐酸浸泡48 h去除杂质，洗净、晒干后装入塑料桶 (直径 20.5 cm、高 20.3 cm)，每桶装石英砂 10 kg，并种植3株宽叶雀稗。

以改良霍格兰营养液为基础，设置5个供氮水平，浓度梯度分别为 N1(1 mmol·L-1)、N2(3 mmol·L-1)、N3(5 mmol·L-1)、 N4(7 mmol·L-1)、 N5(9 mmol·L-1)。其中N3是改良霍格兰营养液标准配方中的氮素水平，设为对照组。改良霍格兰营养液中，大量元素配方如表1所列；铁盐溶液配方为FeSO4·7H2O 13.90 mg·L-1，EDTA 18.61 mg·L-1，pH 5.5～6.5。

表 1 不同氮素水平营养液大量元素的配方Table 1 A large number of elements in nutrient fluids at different nitrogen levels

微 量 元 素 配 方 为 KI 0.83 mg·L-1， H3BO36.20 mg·L-1， MnSO4·4H2O 22.30 mg·L-1， ZnSO4·7H2O 8.61 mg·L-1， Na2MoO40.25 mg·L-1， CuSO4·5H2O 0.03 mg·L-1，CoCl20.03 mg·L-1。每个水平设置 3 次重复，每隔5 d更换一次营养液。分别在7、14、21和28 d进行生理和光合指标的测定。各处理取植株第2片完全展开的叶片，于天气晴朗的上午09：00-11：00进行光合特性的测定，随后将所测叶片剪碎混匀进行生理指标的测定，每次测定重复3次。28 d后测定株高、叶长、叶宽等形态指标，并刈割测定生物量和含氮量，重复3次。

1.2 测定指标及方法

株高、叶长、叶宽、根长用直尺和游标卡测量，鲜重和干重采用称重法。植株含氮量采用凯氏定氮法[13]测定。过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法[14]测定；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度计法[14]测定；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑光还原法[14]测定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[15]测定；可溶性蛋白(SP)含量采用考马斯亮蓝法[14]测定；脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法[14]测定。叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)及总叶绿素(Chlt)含量采用

紫外分光光度计测定。叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)和气孔导度(Gs)等光合指标采用多叶室动态光合仪测定。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件对不同氮素水平下宽叶雀稗各时间段的形态、生理及光合指标进行Duncan方法的显著性分析。采用Excel 2003进行图表的绘制。参照郑清岭等[16]的研究，以处理时间最长(28 d)的各指标作为基础数据，采用主成分分析结合模糊隶属函数公式对氮素处理效果进行综合分析。计算公式如下：

式中：μ(Xi)为各氮素水平Xi的隶属函数值，Xi为各氮素水平综合指标i的值，Ximax和Ximin分别为各氮素水平Xi的最大值和最小值，Pi为综合指标i的贡献率，Wi为综合指标i的权重，D为各氮素水平的综合评价值[17-19]。

2 结果

2.1 氮素水平对宽叶雀稗生长的影响

不同氮素水平下，宽叶雀稗的各项指标变化趋势基本一致(表2)。随着氮素水平增加，株高、叶长、叶宽和根长均出现先升高后降低的趋势。其中，N2处理下各指标达到最大，分别为39.77、31.07、2.03和27.57 cm。N5处理下宽叶雀稗长势最差，与对照组(N3)相比各指标均显著降低(P＜0.05)，分别下降了 16.23%、16.00%、13.71%和17.74%。说明过高的氮素水平不利于宽叶雀稗生长。

表 2 不同氮素水平对宽叶雀稗生长的影响Table 2 Effect of different nitrogen levels on the growth of P. wettsteinii

2.2 氮素水平对宽叶雀稗生物量及含氮量的影响

随着氮素水平逐渐增加，宽叶雀稗的地上和地下部分生物量及含氮量均呈现先上升后下降的趋势，在N2处理下达到最大。除地下部分含氮量外，N2与N3处理下各项指标均无显著差异(P＞0.05)。与N3处理相比，N5处理下降幅度最大，地上和地下部分鲜重、干重及含氮量分别减少了42.43%、56.99%、19.13%和45.19%、71.43%、16.13%。进一步说明，高氮素水平对宽叶雀稗生长有明显的抑制作用(表3)。

2.3 氮素水平对宽叶雀稗生理指标的影响

各处理时间梯度下，宽叶雀稗的SP含量均随着氮素水平增加先升高后下降。不同氮素水平下，宽叶雀稗的SP含量均在28 d达到峰值，分别较处理7 d时的SP含量显著增加309.12%、364.86%、320.63%、325.80%和277.50%。SP是植物体内能缓解环境胁迫对其损伤的一种保护物质。N2处理下SP含量增幅最大，说明N2处理对于宽叶雀稗SP含量积累最有利(图1)。

Pro含量随宽叶雀稗生长时间延长而上升，且各时间段内(除生长7 d外)均表现为随氮素水平的增加先升高后下降。除生长7 d外，其他时间宽叶雀稗中Pro含量均以N2和N3处理较高，尤以N2处理最高。在28 d时，N2处理下的Pro含量达到了 37.35 μg·g-1，显著 (P＜0.05)高于其他处理 (图 1)。

表 3 不同氮素水平对宽叶雀稗生物量分配及含氮量的影响Table 3 Effect of different nitrogen levels on biomass allocation and nitrogen content of P. wettsteinii

图 1 不同氮素水平对宽叶雀稗可溶性糖(SP)和脯氨酸(Pro)含量的影响Figure 1 Effect of different nitrogen levels on soluble protein and proline content of P. wettsteinii

不同氮素水平处理下，宽叶雀稗的MDA含量随着时间增加而增加，总体表现为 N5＞N4＞N1＞N3＞N2。与处理7d相比，N1-N5处理28d 的MDA含量均显著增 加 (P＜0.05)，增幅依次为68.13%、52.19%、56.82%、73.95%和95.93%。N5处理下MDA含量增幅最大，脂膜稳定性最差(图 2)。

随处理时间的延长，各氮素水平下(除N1处理)宽叶雀稗的POD活性均逐步增加，在28 d达到峰值。与处理7 d相比，处理28 d的POD活性均有显著(P＜0.05)增加，以N2处理下POD活性最高，为 1 373.77 U·g-1，N5处理下 POD 活性最低，为 733.01 U·g-1(图 2)。

随处理时间的增加，CAT和SOD活性均不断增加。各氮素水平下CAT活性均在28 d达到峰值，且各处理间存在显著(P＜0.05)差异。与处理7 d相比，N1-N5在处理28 d时的CAT活性增幅分别为565.41%、206.58%、237.25%、260.14%和174.69%。28 d时，N2处理的SOD活性达到最大，为869.29 U·g-1。与 N2相比，N1、N3、N4、N5氮素水平的SOD活性分别下降了27.13%、2.44%、36.69%和49.97%(图 2)。

2.4 氮素水平对宽叶雀稗叶绿素含量的影响

随生长时间的延长，宽叶雀稗叶片中Chl a、Chl b和Chl t的含量基本趋于一致，均先上升后下降。其中，N2、N3和N4处理下宽叶雀稗叶片中叶绿素含量显著高于 N1和 N5(P＜0.05)。与处理 7 d相比 N1-N5在处理 28 d 时的 Chl a 含量分别增加76.91%、39.10%、25.53%、55.54%和92.24%；Chl b含量分别增加 40.52%、61.34%、60.48%、63.93%和 81.63%；Chl t含量分别增加 158.03%、36.07%、32.62%、45.01%和129.16%(图3)。

2.5 氮素水平对宽叶雀稗光合作用的影响

图 2 不同氮素水平对宽叶雀稗MDA、POD、CAT和SOD活性的影响Figure 2 Effect of different nitrogen levels on malondial-dehyde content (MDA), peroxidase (POD),catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activity of P. wettsteinii

随氮素水平的增加，各处理时间段内叶片Pn、Tr和Gs均表现为先上升后下降。随处理时间的推移，Pn、Tr和Gs总体呈现增加趋势。与处理7 d相比，处理28 d时的Pn增幅依次为48.25%、44.09%、25.12%、49.91%和70.84%。28 d时，N2处理下叶 片中Tr较高，尤以N2处理最高，为2.30 mmol·(m2·s)-1。与N2处理相比，N5处理下Tr显著下降了29.13%。与处理 7 d相比，处理 28 d时 Gs明显增长，N2处理下Gs上升幅度最大, 增加了122.31%；N1处理下Gs上升幅度最小，增加了77.65%。Ci处理期间持续减少，N4和N5处理Ci始终高于其他处 理组，两组间无显著差异。28 d时，N4和N5处理下 Ci分别为 372.13 和 378.87 μmol·mol-1(表 4)。

图 3 不同氮素水平对宽叶雀稗叶绿素含量的影响Figure 3 Effect of different nitrogen levels on Chlorophyll content of P. wettsteinii

2.6 氮素处理对宽叶雀稗影响的综合评价

相关性分析发现，各指标间存在极显著(P＜0.01)或显著(P＜0.05)相关关系，因此有必要利用主成分分析将其转变为相互独立的综合指标。

对23个指标进行主成分分析，按照特征值大于1及提取的主成分累积贡献率超过85%，确定前3个主成分为综合指标。前3个主成分的特征根分别为16.56、2.00和1.55，累积贡献率为87.42%。在第1主成分中，POD、CAT和SOD的载荷量较大；在第2主成分中，Chl a、叶宽和叶长的载荷量较大；在第3主成分中，Chl a、Tr和Ci的载荷量较大。

由主成分分析结果可得3个综合指标的线性方程组。其中，X1、X2和X3分别代表了3个主成分，以各指标的载荷量为系数，x1～x23分别代表23个指标。

通过主成分表达式及隶属函数公式分别求出不同氮素水平对宽叶雀稗的综合指标值、隶属函数值、各综合指标权重以及综合评价值(D值)。综合评价值越大，表明氮素水平对宽叶雀稗生长的促进作用越强，反之则弱。结果得出，N2处理的综合评价值最大(0.88)，综合排序第1，表明该氮素处理水平对宽叶雀稗生长最有利(表5)。

表 5 不同氮素水平下宽叶雀稗的综合指标评价及排序Table 5 Comprehensive index and sort of P. wettsteinii in different nitrogen levels

3 讨论

3.1 宽叶雀稗对不同氮素水平的生长、生理及光合适应

在一定范围内添加氮素对植物株高、根长、生物量等表征生长发育的各项指标具有正向调控作用[20]。本研究表明，随着氮素水平的增加，宽叶雀稗的株高、叶长、叶宽、根长、生物量及含氮量均呈先上升后下降的趋势。有研究发现，在氮素供应不足的范围内，氮素含量增加会显著提高株高、生物量及氮含量，一旦超过植物最适氮素的含量，株高、生物量及氮含量等指标将不再增加，甚至会呈现出下降的趋势[21-22]。本研究中，在氮素水平为3 mmol·L-1时，宽叶雀稗的株高、叶长、根长等指标均达到了峰值；之后随着氮素水平的增加，株高、叶长、叶宽等指标开始降低，表明过量的氮素会抑制宽叶雀稗生长。

为了抵御逆境中植物体内积累的大量活性氧，渗透调节物质和保护酶活性均会发生变化，从而减少植物细胞质膜系统的损伤[23]。作为植物的渗透调节物质，SP和Pro含量的高低能反映植物的耐受性。王贺正等[24]研究发现，合理施氮能够提高小麦(Triticum aestivum)叶片的渗透调节能力，降低膜脂过氧化程度。但过高的施氮量会抑制保护酶的活性。本研究中，随着氮素水平的增加，各处理时间梯度下宽叶雀稗的SP和Pro含量、POD、CAT、SOD保护酶活性均呈现先上升后下降的趋势。与对照组相比，氮素水平较低(3 mmol·L-1)处理的宽叶雀稗体内SP和Pro含量、POD、CAT、SOD保护酶活性均保持在较高的水平，这可能是植物对于逆境的一种补偿机制。MDA含量与植物受到的伤害程度呈正比，高氮素水平(7～9 mmol·L-1)下MDA含量显著增加，说明氮素水平过高导致植物细胞内活性氧的大量积累，加速细胞膜脂过氧化作用，更大程度地损伤了植物的质膜系统，影响植物生长。陈继康等[25]研究不同氮素水平对苎麻(Boehmeria nivea)氮代谢关键酶的影响，其趋势变化与本研究结果相似。

光合作用是植物将光能转换为自身生长所需化学能的过程。在这个过程中，叶绿素发挥着光能吸收和转化的重要作用。植物叶片中叶绿素含量是衡量植物光合作用和营养胁迫的重要指标之一[26-27]。有研究表明，增加施氮量可提高植物叶片中叶绿素的含量，从而增强植物自身的光合作用，但浓度过高的氮素却不利于叶绿素含量的积累[28-29]。一般认为气孔限制和非气孔限制是影响植物光合作用的主要因素。Farquhar和Sharkey[30]认为，植物叶片中Pn、Gs与Ci变化趋势一致，说明Pn的降低主要是由气孔因素所致；反之，则表明非气孔限制是Pn降低的主要限制因素。本研究表明，随着氮素水平的增加，Chl a、Chl b 和 Chl t叶绿素含量及Pn、Tr和Gs光合指标均呈现先上升后下降的趋势。而Ci的变化趋势与之相反，表明宽叶雀稗的光合作用是非气孔限制。在氮素水平为1 mmol·L-1时，叶绿素含量均很低，说明此时的宽叶雀稗处于氮饥饿状态，氮素不足阻碍叶绿素合成，影响植株的光合作用，进而影响生长发育。在氮素水平为 3 mmol·L-1时，Chl a、Chl b 和Chl t的含量有所增加，Pn、Tr和Gs显著增加。叶绿素含量在轻微胁迫下增加，这可能是植物对于逆境的一种补偿机制，而叶绿素含量增加有利于增强光合作用，使植物适应在逆境中生长。张绪成和上官周平[31]、陆艳婷等[32]的研究结果也表明，适量的增加氮素会使植物叶片中的叶绿素含量升高，Pn、Tr和Gs也相应增加，而Ci有下降趋势。

3.2 不同氮素水平对宽叶雀稗各指标的综合评价

氮素对植物生长发育有很大的影响，不同的氮素水平下植物各指标的变化也不尽相同。宽叶雀稗对氮素适应是一个复杂过程，单一或是几个指标不能准确表达氮素水平对于宽叶雀稗生长的影响，以上所测各指标间有较强的相关性，用单一或是几个指标评价会出现信息重叠或遗漏的问题，故需要对各指标进行综合分析。孙建等[33]利用主成分分析和隶属函数相结合的方法科学评价了43个单项指标抗旱系数，为芝麻(Sesamum indicum)抗旱性鉴定提供了参考方法。本研究利用模糊隶属函数和主成分分析，对不同氮素水平宽叶雀稗幼苗各指标进行综合分析。宽叶雀稗在不同氮素水平下的综合评价值排序为 N2＞N3＞N1＞N4＞N5。

4 结论

适量的氮素水平可以增加宽叶雀稗的株高、根长、生物量和含氮量，增强酶活性，降低膜脂过氧化程度，增加叶绿素及光合作用。随着氮素水平的增加，对宽叶雀稗生长的抑制明显增强。23个指标经过隶属函数和主成分分析综合评价得出，3 mmol·L-1是最适宜宽叶雀稗生长的氮素水平。该结论为宽叶雀稗推广种植提供了理论基础。