用范氏法测定多类植物中酸性洗涤木质素的影响因素研究

李朝英,郑 路,2*,杨文娟,莫世宇

(1.中国林业科学研究院 热带林业实验中心,广西 凭祥 532600;2.广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站,广西 凭祥 532600)

0 引言

木质素是自然界中唯一可提供再生性芳香基化合物的非石油类资源,是仅次于纤维素的第二大类可再生生物质资源,可作为获取洁净能源和高附加值化学品的原料。木质素含量及其相关酶系活性与植物的生长发育、抗病性、抗逆性密切相关;在造纸工业中,木质素处理是造成环境污染的重要来源[1-2]。因此,木质素的定量分析有着重要意义。应用红外光谱是检测木质素的现代方法,但仪器昂贵,应用有限[3-4]。在20世纪60年代, Van Soest P J提出的范氏法是国际上被广泛应用的经典方法,国内依此方法建立了饲料、谷物木质素的测定标准。范氏法中的样品经酸性洗涤剂消煮后得到酸性洗涤纤维(ADF)，再加入硫酸水解纤维素,所得残渣灰化后的剩余物为酸不溶灰分(AIA),通过残渣与AIA的差重得出酸性洗涤木质素(ADL)的含量[5-7]。在20世纪80年代,国内提出了王玉万法,样品经中性洗涤剂、盐酸沸水浴处理,其后测定操作与范氏法相似。用这两种方法测定农副产品样品ADL的比较分析研究有一些,但目前对用范氏法测定植物样品(尤其是针阔叶、草本植物)ADL的影响因素的报道甚少,用范氏法与王玉万法测定多类植物ADL的比较分析报道较为少见[8]。为此,本实验以针阔叶、竹类及一年生草本植物为样品,对范氏法不同消煮时间、不同硫酸浓度以及酸浸泡不同时间的测定结果进行了比较分析,探讨了影响范氏法测定结果的主要因素；对人工检测、仪器法进行了比较,探寻了人工检测、仪器法测定结果的差异；此外还对范氏法与王玉万法的测定结果进行了比较讨论,以期为实验室准确测定植物木质素提供可行的参考依据。

1 材料及方法

1.1 试剂及仪器

硫酸、丙酮、十六烷三甲基溴化铵、酸性洗涤剂(将20 g十六烷三甲基溴化铵溶于1000 mL的0.5 mol/L硫酸中)、中性洗涤剂(将18.6 g乙二胺四乙酸二钠和6.8 g硼酸溶于少量水中,再加入含有30 g十二烷基硫酸钠、 10 mL乙二醇乙醚、4.56 g无水磷酸氢二钠的溶液,定容至1000 mL)、十氢化萘,以上试剂均为分析纯级别或自行配制。

电子分析天平(1/100000)、石墨加热板、真空泵、马弗炉、烘箱、Fibertec 8000纤维素分析仪、高压锅。

1.2 样品采集与处理

2016年6月于广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站设置在热带林业实验中心伏波实验场的样地中采集30年生马尾松(Pinusmassoniana)人工林内的马尾松侧枝(以下简称马枝)、2年生桉树(Eucalyptusrobusta)人工林内的桉树侧枝(以下简称桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)侧枝(以下简称竹枝)以及在林缘生长的鬼针草(Bidenspilosa)全株(以下简称草株)。将各植物样品在干燥箱(65 ℃)中烘干后粉碎，过40目(粒径≤0.5 mm)筛,并装袋标识。

1.3 实验方法

1.3.1 范氏法 称取样品0.5000 g,加入50 mL酸性洗涤剂,再加入5滴十氢化萘,在瓶口加漏斗,在漏斗中加放玻璃珠,迅速煮沸后保持小沸一定时间,趁热倒入已知重量W0的2G砂芯坩埚抽滤,并用热水冲洗残渣至滤液无泡沫且呈中性；用10 mL丙酮冲洗残渣至滤液呈无色,抽净丙酮并烘干称重得W1；加入5 mL的72%硫酸,充分浸没样品，待硫酸渗滤完毕时及时补加；在室温下放置3 h后,用热水冲洗到中性,将残渣于105 ℃烘箱中烘干称重得W2。将残渣放于550 ℃马弗炉中灰化3 h后,称重得W3。相关计算公式为：酸性洗涤纤维(ADF)含量(%)=(W1-W0)/0.5×100%;硫酸处理残渣含量(%)=(W2-W0)/0.5×100%;酸性洗涤木质素 (ADL)含量(%)=(W2-W3)/0.5×100%。

按上述方法进行操作,在其他实验参数固定的条件下，消煮时间分别设为15、30、60 min，所加硫酸的质量浓度分别设为65%、70%、72%、75%、78%，静置时间分别设为1.5、3.0、4.0、5.5、8.0 h。

1.3.2 仪器法 称取样品,以Fibertec 8000纤维素分析仪按1.3.1操作,各实验参数设置同上。

1.3.3 王玉万法 称取样品0.5000 g,加入50 mL中性洗涤剂,在100 ℃高压锅保温1 h,以2号砂芯漏斗过滤至滤液呈中性,用丙酮洗涤残渣两次；将残渣转移到50 mL比色管中,加入50 mL的2 mol/L盐酸溶液,在100 ℃高压锅保温50 min,以2G砂芯坩埚过滤至滤渣呈中性,用丙酮洗2次,加入72%浓硫酸5 mL,常温水解3 h,再加水45 mL,在室温下过夜；之后烘干、称重、灰化操作同1.3.1。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件对本实验数据进行统计及绘图,使用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 消煮时间对测定结果的影响

由表1可见,用酸性洗涤剂消煮样品15、30、60 min所测定的ADF呈现降低趋势,用硫酸处理后残渣及ADL趋于一致。这说明随着样品消煮时间延长,样品组织中多糖物质被不断溶解,ADF中残留的多糖物质减少,所测ADF随之降低。在加入硫酸后,ADF中残留的多糖物质及其中的纤维素被硫酸水解完全,故硫酸处理后残渣趋于一致,由ADL=硫酸处理后残渣-AIA可知,所测ADL趋于一致。样品经不同时间消煮后所测ADL的SD在0.07～1.78之间,离散度小,精密度良好。

经方差分析,消煮15 min与30 min、60 min所测定的ADF有显著性差异,硫酸处理后残渣及ADL无显著性差异。可见,酸性洗涤剂消煮时间长短对ADF测定有影响；由于硫酸可充分水解ADF中的多糖及纤维素,因此消煮时间对ADL的测定影响不明显。但考虑到洗涤剂充分浸润植物组织,有利于硫酸的渗透,保证组织致密或易飘浮的植物颗粒水解反应完全,本实验提出消煮30 min为宜。

2.2 硫酸浓度对测定结果的影响

由图1可见：随硫酸浓度升高所测ADL呈减小趋势；65%硫酸所测ADL偏高；竹枝以70%、72%、75%硫酸所测结果稳定一致；马枝、桉枝及草株以70%、72%、75%硫酸所测结果呈缓慢下降趋势；各样品以78%硫酸所测结果均持续下降,其中桉枝和草株所测结果降幅明显。这是因为65%硫酸的浓度偏低,ADF中多糖类物质及纤维素水解不充分,ADL偏高;78%硫酸的浓度偏高,在充分水解多糖及纤维素的同时,破坏了木质素结构,使ADL偏低。这说明70%～75%硫酸有利于将植物样品中多糖类物质及纤维素水解充分,且不易破坏木质素结构。

表1 不同消煮时间的测定结果

注:表中测定结果为平均值±标准差。以消煮15 min所测定的ADF为对照组,消煮30 min、60 min所测定的ADF与其相比,同行间无字母的无显著性差异,后标字母a的有显著性差异(P<0.05)。以消煮15 min所测定的硫酸处理后残渣为对照组,消煮30 min、60 min所测定的残渣与其相比,同行间无字母的无显著性差异,后标字母b的有显著性差异(P<0.05)。以消煮15 min所测定的ADL为对照组,消煮30 min、60 min所测定的ADL与其相比,同行间无字母的无显著性差异,后标字母c的有显著性差异(P<0.05)。

由表2可以看出：70%、75%硫酸所测ADL有显著性差异；70%、72%硫酸所测ADL无显著性差异；72%、75%硫酸所测ADL无显著性差异；用70%、72%、75%硫酸所测ADL的CV分别为2.75%～8.03%、2.32%～6.66%、2.62%～6.74%，说明用72%～75%硫酸所测ADL的CV相当,优于用70%硫酸所测的。因此,本实验优选硫酸浓度为72%～75%。以下实验选择72%的硫酸。

2.3 硫酸浸泡样品不同时间对ADL测定的影响

由图2可见:所测样品ADL随着硫酸浸泡样品时间的延长呈下降趋势；浸泡1.5 h所测ADL偏高；浸泡3.0～4.0 h所测ADL趋于稳定一致;浸泡5.5 h,竹枝ADL有明显降幅;浸泡8.0 h,各样品的ADL均有明显降幅。说明浸泡1.5 h,样品中多糖类物质及纤维素未被硫酸水解充分；浸泡3.0～4.0 h,样品中多糖类物质及纤维素水解充分,所测ADL趋于稳定；浸泡5.5 h、8.0 h,所测ADL趋于不稳定。因此,本实验提出硫酸浸泡3.0～4.0 h为宜。

图1 用不同浓度硫酸所测定的ADL

样品ADL/%70%硫酸72%硫酸75%硫酸CV/%70%硫酸72%硫酸75%硫酸马枝38.76±1.2837.76±0.8636.59±0.97 a3.302.322.62竹枝14.19±0.3914.72±0.9815.09±0.762.756.665.04桉枝19.85±1.5419.38±1.0918.11±1.228.035.626.74草株18.33±0.9917.82±0.9116.52±1.06 a5.405.116.42

注:测定结果为平均值±标准差。以70%硫酸所测ADL为对照组,72%、75%硫酸所测ADL与其相比,同行间无字母的无显著性差异,后标字母a的有显著性差异(P<0.05)。以72%硫酸所测ADL为对照组,70%、75%硫酸所测ADL与其相比,同行间无字母的无显著性差异,后标字母b的有显著性差异(P<0.05)。

2.4 范氏法人工检测、仪器法与王玉万法测定结果的比较

由表3可见：范氏法人工检测所测ADL的CV在2.32%～6.66%之间；仪器法所测ADL的CV在0.32%～1.10%之间。因此范氏法人工检测ADL的精密度低于仪器法的，说明人工检测中的样品消煮、转移、抽滤过程易造成样品损失,检测误差大，而仪器法中的样品消煮、酸浸泡及抽滤清洗等操作均在坩埚中进行,样品无需转移,避免了样品损失,误差小。

由表3还可以看出,王玉万法所测ADL的CV在2.31%～5.19%之间,其精密度略高于范氏法人工检测的。这是因为王玉万法中的样品以保温处理,不回流消煮,避免了一些误差。王玉万法加硫酸静置3 h后,加水以稀酸浸泡样品过夜,不同于范氏法,这有利于残留多糖或纤维素进一步水解,从而降低了误差。

经方差分析,范氏法人工检测与仪器法所测ADL无显著性差异,范氏法人工检测与王玉万法所测ADL无显著性差异。可见,范氏法与王玉万法检测系统中所用洗涤剂不同,样品处理条件不同,但两种方法的测定结果基本一致。

表3 范氏法人工检测、仪器法与王玉万法的测定结果

注:测定结果为平均值±标准差。以人工检测结果为对照组,仪器法和王玉万法所测结果与其相比,同行间无字母的无显著性差异。

图2 浓硫酸处理样品不同时间的测定结果

3 结论

本实验结果表明：消煮时间对ADL测定影响不明显；硫酸浓度及浸泡时间对ADL的测定有一定影响；用酸性洗涤剂消煮30 min,用72%～75%硫酸浸泡样品3～4 h,可充分水解植物细胞壁中的果胶、蛋白、半纤维素、纤维素,清除ADL测定干扰物,保证ADL的准确测定；范氏法人工检测与仪器法所测ADL无显著性差异,人工检测易存在人为偏差,其所测结果的精密度低于仪器法的[9-10]；范氏法与王玉万法所测针阔叶、草本植物样品的ADL无显著性差异,这两种方法有较好的可比性。

4 讨论

范氏法对样品消煮1 h,再用72%硫酸浸泡3 h。本实验结果表明,当植物样品经酸性洗涤剂消煮30 min,再用72%～75%硫酸浸泡3～4 h时,所测结果准确稳定。本实验所述检测条件较原方法有较强的可操作性。为了保证检测结果的可比性,建议同批量样品检测所用硫酸浓度及浸泡时间应保持恒定。

木质素结构复杂,有资料认为多年生的针阔叶不适合用范氏法测定ADL,目前有关用不同方法测定不同类型植物样品木质素的分析讨论甚少[3,11-12]。本实验采用范氏法与王玉万法测定针阔叶、草本植物样品的ADL，这两种方法的测定结果趋于一致,有较强的可比性。这表明用两种方法测定针阔叶、草本植物的ADL有一定的适用性。