小檗碱对大鼠口服阿托伐他汀钙药代动力学的影响

潘 兴，王黎青，杨远霞

0 引言

阿托伐他汀(Atorvastatin)自1999年在中国上市以来，是中国使用最广泛的降脂药物，约占心血管疾病二级预防总他汀用量的40%[1-2]。同时也是世界上使用最广泛的他汀类药物[3]。小檗碱(Berberine)是从黄连、黄柏、三颗针等植物中提取分离出的生物碱，也叫黄连素[4]，对细菌有微弱的抑菌作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌引起的肠道感染有效。近年来的研究表明，小檗碱还有降脂作用[5]，其可能机制是通过抑制肝脏PCSK9的活性，使LDL-C受体表达增加，进而减少血清中LDL-C水平；还可以通过激活AMP激酶和阻断MAPK/ERK通路来降低三酰甘油水平[6]。由于小檗碱与他汀类不同的降血脂机制，小檗碱与阿托伐他汀联合用药的文献报道较多[7-9]。同时，较多的文献表明，小檗碱对体内外细胞色素P450 3A(CYP3A)及P-糖蛋白(P-gp)均存在一定的影响，但因小檗碱给药剂量不同、研究方法不同，其结论不同甚至相反[10-14]。阿托伐他汀作为CYP3A4与P-gp的共同底物[15]，与小檗碱联合用药时很有可能产生药物相互作用。本研究探讨小檗碱对阿托伐他汀钙体内药代动力学的影响，以指导临床合理联合用药。

1 材料

1.1 药品及试剂 阿托伐他汀钙片(规格：20 mg/片，批号：T28958，辉瑞制药有限公司)；盐酸小檗碱片(规格：0.1 g/片，批号：2170440，东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；阿托伐他汀钙标准品(HPLC>98%，购自大连美仑生物技术有限公司，批号：J1203AS)；乙腈(色谱级，BCR国际贸易公司)；甲醇(色谱级，BCR国际贸易公司)；氯化钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170401)；磷酸二氢钠(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10102702)；磷酸(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10113901)；纯净水(实验室自制双蒸水)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司Agilent 1100系列)；安捷伦色谱柱 Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；Eppendorf Centrifuge 5415R-小型高速冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)；XW-80A型漩涡振荡混合器(上海第一医学院仪器厂)；十万分之一电子分析天平(上海光正医疗仪器有限公司)；KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；4 ℃冰箱(新飞电器集团有限公司)；-20 ℃冰箱(美国Revco立式超低温冰箱)；-80 ℃冰箱(美国NBS公司)。

1.3 动物 SPF级SD雄性大鼠，体重350～380 g，采购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2016-0041，编号：44002100015649。动物饲养于无毒塑料盒中，每盒6只，每3天更换一次垫料，自由摄食和进水，保持室内温度18～29 ℃，相对湿度40%～70%，自然光照。正常饲养1周后使用。每次给药前禁食12 h，给药后禁食2 h，不禁水。

1.4 药液配置 阿托伐他汀钙标准储备液：精密称取阿托伐他汀钙5.0 mg，至10 ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得阿托伐他汀钙储备液500 μg/ml，-20 ℃储存备用。饱和氯化钠溶液：量取50 ml纯净水，加入氯化钠直至饱和，4 ℃储存备用。灌胃给药用阿托伐他汀钙：取阿托伐他汀钙片3片(60 mg)置于小烧杯中，加入20 ml蒸馏水，使用玻璃棒不停搅动，使其均匀分散于水中，配置为3 mg/ml的阿托伐他汀钙混悬液，使用前摇匀。灌胃给药用盐酸小檗碱：取盐酸小檗碱片2片(200 mg)置于小烧杯中，加入10 ml蒸馏水，使用玻璃棒不停搅动，使其均匀分散于水中，配制为20 mg/ml的盐酸小檗碱混悬液，使用前摇匀。

2 方法

2.1 给药方案 SD健康雄性大鼠共30只，随机分为5组：A组单独以阿托伐他汀钙20 mg/kg的剂量灌胃；B组先予小檗碱30 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀钙20 mg/kg相继灌胃；C组先予小檗碱90 mg/kg灌胃，5 min后阿托伐他汀钙20 mg/kg相继灌胃；D组以小檗碱30 mg/kg连续灌胃6 d，在第7天灌胃给药小檗碱5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀钙灌胃给药；E组以小檗碱90 mg/kg连续灌胃6 d，在第7天灌胃给药小檗碱5 min后，以20 mg/kg阿托伐他汀钙灌胃给药。于阿托伐他汀钙给药前及给药后0 min、10 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h眼眶采血约300 μl，收集于含肝素的1.5 ml离心管中，在3 600 r/min离心10 min，分离上清液，于-80 ℃留存，用于阿托伐他汀钙含量检测。

2.2 血浆样品处理 精密量取100 μl血浆样品，置于1.5 ml塑料离心管中，加入250 μl乙腈，50 μl 饱和氯化钠溶液，漩涡混合1 min，12 000 r/min离心10 min，取200 μl上清液于1.5 ml离心管中，自然挥干，用30 μl乙腈复溶，旋涡混合30 s，取20 μl进样分析。

2.3 色谱条件 色谱柱：安捷伦Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm)；流动相：水(0.01 mol/L的磷酸二氢钠，pH=3.3)-乙腈=30∶70；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；检测波长：245 nm。

2.4 方法学验证

2.4.1 特异性考察 通过比较来自6只不同SD大鼠的空白血浆色谱图，加入阿托伐他汀钙标准品的空白血浆色谱图以及血浆样品的色谱图来反映方法的特异性。检测血浆中是否有代谢产物、杂质、分解产物、基质组分等干扰样品的检测。

2.4.2 标准曲线及定量范围 取阿托伐他汀钙的标准储备液适量，用乙腈逐级稀释成浓度为20、16、8、4、2、1、0.6 μg/ml的阿托伐他汀钙溶液。分别取上述各浓度的阿托伐他汀钙溶液各10 μl，加入100 μl的空白血浆，分别配成阿托伐他汀钙终浓度为2 000、1 600、800、400、200、100、60 ng/ml的标准样品。按“2.2”项下方法处理样品，按“2.3”项下色谱条件进行检测。以阿托伐他汀钙标准样品的峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标作图，采用最小二乘法计算线性回归方程的斜率、截距、相关系数，获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围。定量下限的信噪比(S/N)不小于10。

2.4.3 准确度和精密度考察 取阿托伐他汀钙的标准储备液适量，用乙腈分别稀释成浓度为15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀钙溶液。分别取以上各浓度的阿托伐他汀钙溶液各10 μl，加入100 μl的空白血浆，分别配成阿托伐他汀钙终浓度为1 500、500、150 ng/ml的质控样品溶液。按“2.2”项下方法处理样品，按“2.3”项下色谱条件同一天内进样5份，计算日内精密度和准确度；连续3 d内每天进样1份，计算日间精密度和准确度。准确度表示为：测量值/真实值×100%，精密度表示为：测量值的相对标准偏差(RSD)。准确度应在85%～115%范围内，在定量下限附近应在80%～120%范围内。精密度应<15%，在定量下限附近应<20%。

2.4.4 提取回收率考察 取阿托伐他汀钙的标准储备液适量，用乙腈分别稀释成浓度为15、5、1.5 μg/ml的阿托伐他汀钙溶液。分别取以上各浓度的阿托伐他汀钙溶液各10 μl，加入100 μl的乙腈(代替空白血浆)，分别配成阿托伐他汀钙终浓度为1 500、500、150 ng/ml的样品溶液，每个浓度平行操作5份。按“2.2”项下方法处理样品(加入150 μl乙腈)，按“2.3”项下色谱条件同一天内进样，将“2.4.3”项下操作测得的平均峰面积与此次检测得到平均峰面积相比，即得提取回收率，其结果应精密和可重现。

2.4.5 稳定性考察 同“2.4.3”配置阿托伐他汀钙终浓度为1 500、500、150 ng/ml的质控样品溶液。按“2.2”项下方法处理样品，分别放置于室温4 h和24 h，-80 ℃冻存3 d和7 d，按“2.3”项下色谱条件进行检测，每次检测样品平行操作3份，考察样品处理后阿托伐他汀钙的室温和冻存稳定性。

3 结果

3.1 特异性 大鼠的空白血浆色谱图、加入阿托伐他汀钙标准品的空白血浆色谱图以及血浆样品的色谱图见图1，从图中可以看出，待测样品峰形良好，与前后峰的分离度均>2(R>2)，符合检测要求。

图1 血浆样品中阿托伐他汀钙典型色谱图

3.2 标准曲线及定量范围 以阿托伐他汀钙标准样品的峰面积为Y轴，浓度为X轴，采用最小二乘法进行线性回归，得到阿托伐他汀钙的标准曲线为Y=0.096 7 X+6.119 7，相关系数为R2=0.999 8，标准曲线满足生物样品分析的要求。定量范围为60～2 000 ng/ml，定量下限为60 ng/ml。

3.3 准确度和精密度 血浆中阿托伐他汀钙的3个质控样品(1 500、500、150 ng/ml)的日内及日间准确度和精密度见表1，结果表明，本方法的精密度和准确度满足要求。

表1 血浆中阿托伐他汀钙的日内和日间精密度及准确度

3.4 提取回收率 阿托伐他汀钙的3个质控浓度(1 500、500、150 ng/ml)在血浆中的提取回收率在87.1%～95.0%之间，表明该方法对血浆中阿托伐他汀钙具有良好的提取回收率。见表2。

表2 阿托伐他汀钙在血浆样品中的回收率

3.5 稳定性 经过测定，阿托伐他汀钙的3个质控浓度(1 500、500、150 ng/ml)样品处理后在室温下放置4 h和24 h，-80 ℃冻存3 d和7 d，所有样品的稳定性均在15%以内。

3.6 药动学研究

3.6.1 大鼠单次灌胃小檗碱对阿托伐他汀钙的药代动力学影响 大鼠单次灌胃阿托伐他汀钙(A组)、单次小剂量小檗碱+阿托伐他汀钙(B组)及单次大剂量小檗碱+阿托伐他汀钙(C组)的血药浓度-时间曲线见图2，各组药代动力学参数见表3。

图2 大鼠单次灌胃小檗碱后体内阿托伐他汀钙药时曲线

表3 大鼠单次灌胃小檗碱后阿托伐他汀钙的药动学参数

3.6.2 大鼠多次灌胃小檗碱对阿托伐他汀钙的药代动力学影响 大鼠单次灌胃阿托伐他汀钙(A组)、多次小剂量小檗碱+单次阿托伐他汀钙(D组)及多次大剂量小檗碱+单次阿托伐他汀钙(E组)的血药浓度-时间曲线见图3，各组药代动力学参数见表4。

表4 大鼠多次灌胃小檗碱后阿托伐他汀钙的药动学参数

图3 大鼠多次灌胃小檗碱后体内阿托伐他汀钙药时曲线

4 讨论

近年来，双重药物相互作用的概念，特别是涉及P-gp和CYP3A的概念，受到了广泛关注[16-17]。肠壁细胞中CYP3A介导的药物代谢和P-gp介导的药物逆转运，限制了进入全身循环的药物总量，降低了药物的口服生物利用度。而且肠道中P-gp和CYP3A4之间存在相互影响，P-gp通过延长药物与CYP3A4酶的接触，降低药物的跨细胞转运，从而增加药物被肠壁CYP3A4代谢的机会，并影响药物代谢的程度[18]。作为P-gp和CYP3A4的双重底物，阿托伐他汀存在多样性的药物相互作用，据统计，目前已发现461个药物会与阿托伐他汀发生药物相互作用[15]。因此，在阿托伐他汀的联合用药过程中，应特别注意药物相互作用的影响，尤其与P-gp和/或CYP3A4的抑制剂/诱导剂合用时。

小檗碱通常被认为是安全无毒的[19]，但在临床应用过程中有发生不良反应致死的报道[20]，也发现了很多的药物相互作用[21-22]。深入研究发现，小檗碱所导致的药物相互作用主要与其影响CYP450酶和P-gp的活性有关，但对于P-gp和CYP3A的影响，各项研究的结论有所不同[10-14]。自研究者发现了小檗碱的降脂作用后，在临床将其与阿托伐他汀钙联合用药的情况越来越多，因此，研究两者之间的药物相互作用是十分必要的。

在本研究中，我们将成人盐酸小檗碱片的正常用量换算为大鼠的给药剂量，研究小檗碱在正常剂量给药下对阿托伐他汀钙药代动力学的影响。研究结果表明，大鼠在单次及多次灌胃不同剂量的小檗碱后，阿托伐他汀钙体内药代动力学参数的改变无统计学意义，虽然多次给予大剂量小檗碱(90 mg/kg)后，阿托伐他汀钙的Cmax及AUC均有不同程度的升高，但与单用阿托伐他汀钙相比差异无统计学意义。研究结果与小檗碱对辛伐他汀的药动学影响类似[23]。本研究结果提示，临床在联合使用两药时，正常用量下小檗碱可能不会对阿托伐他汀钙的药动学造成影响，但由于本研究是在大鼠体内进行的，与人体内的药动学变化是否一致，仍需进一步的研究。