甘薯汁对果蝇寿命及抗氧化能力的影响

张碧莹，钱籽霖，唐 玲，张 静，蒋和体*

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

甘薯味道甜美，营养价值高，富含VA、VB、VC、VE、β-胡萝卜素、叶酸、类黄酮、酚酸等天然抗氧化成分[1]。日本国立癌症预防研究所公布的抗癌蔬菜中，甘薯名列榜首[2]。研究表明，清除自由基的抗氧化类食品可表现出不同程度的延缓衰老作用[3]，尤其值得一提的是紫甘薯提取物具有延长果蝇寿命[4]、抑制肿瘤细胞增殖[5]、保护由叔丁基过氧化氢氧化应激所致的小鼠肝细胞损伤等功效[6]。

近年来，关于甘薯的研究集中在植物化学物质提取、分离纯化和生物活性方面，如糖酯类、酮类提取物的抗癌功能，花色苷类提取物的抗突变功能，有机酸类提取物抑制黑色素产生功能，甘薯糖蛋白的降血脂、降血糖、抗突变、抗衰老功能[7-9]。国内对于甘薯汁饮料的研究也局限在工艺水平，其深加工产品及药用功效方面的研究较少。如果甘薯及其制品中的多糖、糖蛋白等功能因子成分在抗衰老的预防及抗氧化效果上存在某种交互作用，则可以摒弃经济成本高且繁琐的提取工艺，选择一种加工简便、经济划算、符合人们消费理念及营养追求的方便饮品（如甘薯汁）来满足人们通过合理膳食达到抗衰老的需求。本实验选用遗传学模式生物——果蝇进行生命周期实验及体内生化指标测定，研究甘薯汁对果蝇寿命及体内抗氧化酶活性的影响，旨在为甘薯汁在抗衰老方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）由西南大学生命科学学院动物遗传学教研室提供。

甘薯品种为‘渝薯17号’，取自重庆市石柱县甘薯基地。测得‘渝薯17号’主要成分含量分别为：水分77.62%（质量分数，下同）、总灰分1.50%、淀粉16.21%、多糖21.60%、蛋白质1.51%、脂肪0.19%、VC 24.12 mg/100 g、β-胡萝卜素3.16 mg/100 g。玉米粉、琼脂、白糖、酵母粉均购自永辉超市。

丙酸、考马斯亮蓝G-250（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004A 电子天平 上海精天电子仪器厂；VD-650型无菌操作台 苏州净化设备有限公司；QL-901型漩涡混匀器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；WFJ 7200型可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；HWS-26数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；HERMLE2323K低温高速离心机 上海精密仪器有限公司；JYZ-E96原汁机 九阳股份有限公司；玻璃匀浆器 上海雷布斯仪器有限公司；HH BII 600-S电热恒温生化培养箱 上海跃进医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 甘薯汁的制备

甘薯清洗、去皮后刨丝，采用螺旋压榨使汁液与薯渣分离（出汁率约为50%～65%），5 000 r/min离心20 min，取上清液于微波炉中加热至90 ℃，保持40～60 s灭酶，冷却至室温。添加α-淀粉酶0.33 mL/kg，于63 ℃水浴中液化，2.0 h后灭酶处理并冷却；再加入复合糖化酶0.40 mL/kg，于61 ℃水浴中糖化，2.0 h后灭酶处理。酶解液用100 目细纱布过滤，灌装于马口铁罐中，于121 ℃高温蒸汽杀菌15 min。

测得所制甘薯汁样品含蛋白质1.43%（质量分数）、VC 4.00 mg/100 g、β-胡萝卜素1.04 mg/100 g、总酚691.73 mg/L、黄酮520.94 mg/L。样品置于4 ℃冷藏备用。

1.3.2 果蝇培养基的制备

1.3.2.1 基础培养基

基础培养基的配制参考李津[4]的方法并略作改动：玉米粉72 g、无水葡萄糖72 g、琼脂粉6 g、干酵母粉10 g、丙酸6 mL、水750 mL。将无水葡萄糖、琼脂粉边缓慢倒入已盛水的锅中加热，边不停搅拌，待充分溶解后将已搅拌均匀的玉米糊倒入锅中，煮沸，停火后冷却2 min左右至80 ℃加入酵母粉及丙酸。趁热分装于经180 ℃干热灭菌2 h的培养管中，每管培养基高度约2.0～3.0 cm，室温放置到凝固后再转移到培养箱中，备用。

1.3.2.2 样品培养基

在基础培养基中添加甘薯汁溶液，分别配制质量浓度为0.10、0.15、0.20 mg/mL的低、中、高3 组剂量的培养基，搅拌均匀后立即分装于经180 ℃干热灭菌2 h的培养管中，每管培养基高度约2.0～3.0 cm，室温放置到凝固后再转移到培养箱中备用。

1.3.3 抗氧化性的测定

采用邻二氮菲法[10]测定羟自由基（·OH）清除率；采用邻苯三酚法[11]测定超氧阴离子自由基（O2-·）清除率；2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定方法参考文献[12-13]。

1.3.4 果蝇寿命的测定

收集1 600 只8 h内羽化未交配的果蝇，随机分为对照组和3 个质量浓度梯度组，每组果蝇雌、雄各200 只，对照组饲喂基础培养基，剂量组饲喂含甘薯汁的培养基。饲养条件：（25±1）℃、相对湿度50%～70%，避光。每隔48 h记录死亡数，计算平均寿命、半数死亡时间和最高寿命等指标。最后10 只果蝇死亡时间的算术平均数作为最高寿命[14]。重复实验3 次。

1.3.5 果蝇SOD活力、T-AOC、MDA含量的测定

参考文献[15-16]的方法，收集6 000 只8 h内羽化未交配的果蝇，随机分为对照组和3 个质量浓度梯度组，每组果蝇雌、雄各750 只，饲喂管理条件同1.3.4节，于第0、10、20天时测定每组果蝇体内的SOD活力、T-AOC及MDA含量。每个样本称取雄蝇48 mg、雌蝇56 mg，分别加入0.6、0.7 mL生理盐水，在冰浴条件下用玻璃匀浆器制备匀浆。根据试剂盒按步骤测定每组果蝇组织上清液中SOD活力、T-AOC及MDA含量，测定结果分别以U/mg pro、mL/mg pro和nmol/mg pro表示。重复实验3 次。

1.3.6 果蝇蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法[17]，适当稀释1.3.5节果蝇组织匀浆上清液，于595 nm波长处测定吸光度，每组设置3 个重复。以牛血清白蛋白为标准物，得标准曲线方程为：y＝4.707 1x-0.003 9，R2＝0.997 2。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），实验重复3 次，数据以±s表示，制图使用Origin 8.6软件。

2 结果与分析

2.1 甘薯汁的抗氧化活性

图 1 不同质量浓度甘薯汁清除自由基能力Fig. 1 Free radical scavenging activity of sweet potato juice at different concentrations

由图1可知，对于O2-·及·OH来说，甘薯汁清除能力随质量浓度升高而增强，且质量浓度达到0.20 mg/mL时清除能力最强，分别达到75.36%和55.25%。对ABTS阳离子自由基及DPPH自由基的清除率范围在86.99%～98.31%，且自由基清除率随质量浓度变化不大。以上结果表明甘薯汁具有良好的体外抗氧化作用，这可能与甘薯汁具有较高含量的总酚、黄酮等活性物质有关。

2.2 甘薯汁对果蝇寿命的影响

表 1 不同质量浓度甘薯汁对果蝇寿命的影响（n＝200）Table 1 Effects of different concentrations of sweet potato juice on life span in D. melanogaster (n= 200)

由表1可知，各甘薯汁剂量组雌、雄果蝇半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命均高于对照组，且存在质量浓度依赖关系。与对照组相比，各甘薯汁剂量组雌性果蝇的半数死亡时间分别延长了3、6、10 d（P＜0.05），雄性果蝇分别延长了2、4、7 d（P＜0.05）。对于果蝇的平均寿命，雌性果蝇3 个剂量组平均寿命延长率分别达到了5.31%、11.17%和17.93%，雄性果蝇分别达到了4.79%、9.40%和16.00%。最高寿命可以体现出果蝇对具有功能因子物质的适应性及耐受性[18]，其中高剂量组对平均最高寿命的延长效果最佳，雌、雄果蝇平均最高寿命分别延长了6.20、4.75 d（P＜0.01），与对照组相比分别提高了8.63%、6.75%，低剂量组对雌、雄果蝇平均最高寿命延长差异不显著（P＞0.05）。通过雌、雄组的对比还可以发现，雌果蝇的平均寿命、平均最高寿命以及半数死亡时间均比雄果蝇增长快，说明甘薯汁对雌果蝇寿命影响高于雄果蝇，这可能是雌性果蝇与雄性果蝇对受试药物的敏感性不同造成的[19]。

图 2 不同甘薯汁剂量组雄性（A）和雌性（B）果蝇存活率Fig. 2 Survival curves of male (A) and female (B) fl ies with dietary supplementation of different concentrations of sweet potato juice

由图2可知，在果蝇生长初期（0～24 d），对照组和各剂量组存活率差异不明显（P＞0.05）；从48 d后果蝇存活率发生了明显改变，各剂量存活率均高于对照组，且高剂量组的延寿效果最为明显（P＜0.05）。综合表1和图2的结果，分析果蝇半数死亡时间、平均寿命、平均最高寿命及果蝇不同时期的存活率，发现高剂量组效果更好，这对甘薯汁保健药用开发具有一定的参考价值。

2.3 甘薯汁对果蝇SOD活力的影响

SOD是机体抗氧化系统具有代表性的酶类，能专一地清除体内有害自由基，避免其氧化体内的某些成分致使机体受到损害[20]。Cutler[21-23]和Wang Haifeng[24]等发现SOD对12 种灵长类和两种啮齿类动物代谢率具有重要作用。Tolmasoff等[25]也曾报道灵长类动物的寿命与SOD活力有关。

表 2 不同质量浓度甘薯汁对果蝇SOD活力的影响（n＝200）Table 2 Effects of different concentrations of sweet potato juice on SOD activity in D. melanogaster (n= 200)U/mg pro

表2显示了新羽化果蝇用添加了甘薯汁的培养基饲养第0、10、20天时其SOD活力的变化。果蝇SOD活力随果蝇生长时间的延长呈先上升后下降的趋势，即清除氧自由基的能力有所降低，这与张欣文等[26]的研究结果相符合。与对照组相比，低、中剂量组雌、雄果蝇在饲喂样品第10天时SOD活力均较同时间对照组有显著差异（P＜0.05）。中、高剂量组雌、雄果蝇在第10、20天时SOD活力与对照组相比有极显著差异（P＜0.01），其中高剂量组在第10天时雌、雄果蝇体内SOD活力都为最高，分别为22.20、24.87 U/mg pro，较对照组提高了50.51%和58.61%。表明在一定甘薯汁质量浓度范围内，果蝇体内SOD活力随质量浓度提高而增强[4]。且雄蝇在饲喂第10、20天时体内SOD活力均比雌蝇高，说明甘薯汁对提高雄果蝇体内SOD活力表现出更强的作用，能增强机体抗氧化脂质程度。

2.4 甘薯汁对果蝇T-AOC的影响

总抗氧化物是体内非酶促和酶促系统抗氧化物质的总和，T-AOC可综合反映机体的抗氧化能力[27]。雌、雄果蝇在食用不同质量浓度甘薯汁添加物10、20 d后，分别检测与氧化应激能力相关的抗氧化物质T-AOC。

由表3可知，果蝇T-AOC随果蝇生长时间的延长呈先上升后下降的趋势，与SOD活力变化相同。饲喂样品第10天时，中剂量组较对照组能显著提高雄、雌果蝇T-AOC，分别提高35.97%和26.78%（P＜0.05）；高剂量组能极显著提高雄、雌果蝇的T-AOC（P＜0.01），分别高达5.97、5.32 mL/mg pro，较对照组分别提高62.67%和79.73%。甘薯汁表现出较强的抗氧化活性，很可能源于其上调SOD和T-AOC mRNA的表达水平，通过消除氧自由基抑制脂质过氧化物的产生和提高抗氧化酶活性的途径发挥延缓衰老的作用[28]。

表 3 不同质量浓度甘薯汁对果蝇T-AOC的影响（n＝200）Table 3 Effects of different concentrations of sweet potato juice on T-AOC in D. melanogaster (n = 200)mL/mg pro

2.5 甘薯汁对果蝇MDA含量的影响

MDA是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的最终产物，它与蛋白质、肽类或脂类聚合物交联，不断堆积老年色素或脂褐质，致使机体衰老[29-30]。MDA含量与自由基数量、脂质过氧化的程度变化趋势一致，因此MDA含量能客观地反映机体自由基的水平及脂质过氧化程度[31]。

表 4 不同质量浓度甘薯汁对果蝇MDA含量的影响（n＝200）Table 4 Effects of different concentrations of sweet potato juice on MDA content in D. melanogaster (n= 200)nmol/mg pro

由表4可知，MDA含量随着果蝇生长时间的延长而呈现升高的趋势，这是因为培养初期果蝇处于青年期，清除体内自由基的能力较强，酶的活性也相对较高，能更好地抑制体内脂质过氧化产物的生成。当果蝇步入机体衰老期，伴随着生理和免疫功能大幅度下滑，体内非酶促与酶促系统清除自由基的能力也依次下降，这与健康成年人体内MDA含量的变化情况相似[32-33]。对照组的MDA含量增加幅度比各剂量组的MDA含量增加幅度要大，说明甘薯汁有延缓果蝇体内MDA含量增加的作用。第10、20天时，低剂量组较同时间对照组没有显著差异（P＞0.05），中剂量组有显著性差异（P＜0.05），高剂量组有极显著性差异（P＜0.01）；其中第20天时，高剂量组雌、雄果蝇较同时间对照组分别降低了35.59%和37.14%。同一剂量组中雌蝇的MDA含量比雄蝇高，这可能是由于雄蝇体型较小，体内的脂质含量少，过氧化脂质程度低，故其体内MDA含量较少[34]。

3 讨 论

果蝇生存史短暂、繁殖速度高、饲养条件简单，且具有与人类相似的代谢途径和衰老基因[35-36]，已在卫生部发布的《保健食品功能学评价程序和检验方法》中被用作动物模型来研究抗衰老活性及动物抗衰老机制。机体清除自由基的能力和自由基代谢产物的含量是决定衰老速度的重要因素[37-39]。本实验通过果蝇生存实验和生化指标测定法分析了果蝇半数死亡时间、平均寿命和平均最高寿命，果蝇体内SOD活力、T-AOC、MDA含量等变化情况。结果表明，甘薯汁各剂量组均能延长果蝇的寿命，在一定甘薯汁质量浓度范围内和清除自由基能力呈正相关，且果蝇体内抗氧化酶的活性随年龄的增大而呈现降低趋势。但由于物种间存在一定差异，甘薯汁对果蝇延缓寿命及提高抗氧化能力的作用并不能完全代表其对人体具有疗效，其抗衰老临床应用亟待研究。