短波紫外线控制鲜切苹果褐变与其活性氧代谢的相关性

周 琪，陈 晨,2,*，周福慧，胡文忠,2，赵 蕾，许源源

（1.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600；2.生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600）

鲜切苹果清脆多汁且富含多种抗氧化营养物质，是餐饮行业、学校营养配餐以及家庭消费中广受欢迎的鲜切产品之一；其目前在欧洲、美国、日本等发达国家已经实现系统化、规范化生产，在鲜切市场中占有重要地位[1]。然而鲜切机械操作破坏了苹果细胞结构的完整性，使得本来因区域化分布而被分隔开的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和酚类物质接触，诱发了酶促褐变反应，从而降低鲜切苹果的贮藏品质，严重影响其商品价值[2-3]。短波紫外线（ultraviolet-C，UV-C）处理被认为是一种安全的杀菌技术，目前已允许其用于食品表面的杀菌[4]。本课题组前期研究以及文献报道均表明适宜剂量的UV-C处理可以有效控制鲜切苹果贮藏期间的褐变，同时保持其营养品质[5-7]；但UV-C处理并不能抑制PPO活力或降低总酚含量[5]，因此推测UV-C可能是通过其他途径抑制鲜切苹果的褐变。

近年来，越来越多研究表明酶促褐变不仅与酚类物质含量以及PPO活力有关，还受细胞膜透性以及膜脂过氧化等多因素影响。例如Toivonen[8]、Cantos[9]、Li Zhenghong[10]等的研究均表明细胞膜的完整性是影响鲜切果蔬褐变速率的关键因素。UV-C处理有助于提高鲜切杨桃贮藏过程中细胞膜的完整性，进而控制其褐变反应[11]。细胞膜被破坏除了是鲜切处理带来的直接机械损伤外，更主要是机械损伤引发大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，引起了细胞膜的氧化损伤和破坏，最终导致细胞膜的区室化功能丧失，从而加快了酶促反应的发生。提高抗氧化能力、缓解ROS引发的氧化损伤及膜脂过氧化，进而维持细胞膜的完整性，可以有效控制鲜切果蔬贮藏过程中的褐变进程[5,12-13]。由此可见，鲜切果蔬褐变反应与ROS代谢有着密切的关系[14]。研究发现适宜剂量的UV-C处理能维持草莓果实采后ROS代谢通畅，抑制膜脂过氧化反应发生，延缓果实衰老的发生。但UV-C控制鲜切苹果褐变与其ROS代谢相关性仍缺乏系统研究。

本研究以鲜切苹果为研究对象，分析UV-C处理后鲜切苹果在贮藏过程中ROS水平、抗氧化相关酶活力、抗氧化物质含量以及非酶抗氧化能力的变化，系统研究UV-C处理对鲜切苹果褐变控制与ROS代谢的相关性，为鲜切苹果的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富士苹果购于大连经济技术开发区乐购超市。L-蛋氨酸、氮蓝四唑、聚乙烯吡咯烷酮、亚油酸钠、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、冰醋酸、核黄素、浓氨水、浓硫酸、四氯化钛、无水乙醇、丙酮等（均为分析纯） 天津市科密欧化学试剂开发中心；2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

CR400/CR410型色差计 日本Konica Minolta公司；DK-S26电热恒温水浴锅、恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；AL240电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；UV-C-9200紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；T-25匀浆机 德国IKA公司；DHG-9053A电热BR4i台式高速冷冻离心机 法国Jouan公司；SiM-F140制冰机 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的预处理

苹果经自来水清洗后，在灭菌砧板上用灭菌的削皮刀削皮去除果核，切割成约1 cm3的小块，采用4.5 kJ/m2的UV-C对鲜切苹果进行辐照处理5 min[5]，以未处理的样品作为对照，将对照样品和处理后的样品均匀放入一次性托盘中并用聚乙烯保鲜膜包好，置于4 ℃冷库中贮藏10 d，每2 d取样用于分析生理生化变化。

1.3.2 指标的测定

1.3.2.1 褐变指数

采用色差计测定L*、a*、b*值，褐变指数根据下式计算[15]。

1.3.2.3 VC含量

VC含量的测定采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[17]。

1.3.2.4 抗氧化酶酶活力

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化酶（ascorbate peroxidase，APX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活力测定参考闫媛媛等[18]的方法，谷胱甘肽还原酶（glutathion reductase，GR）活力测定参考Zhang Jie等[19]的方法。

1.3.2.5 抗氧化活力

抗氧化活力的测定采用DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力以及还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）3 种方法，具体方法参考文献[20]。以水溶性VE（Trolox）为标准抗氧化物质，样品的抗氧化活力以每克样品中Trolox的物质的量表示。

1.3.2.6 丙二醛含量

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定参考Ren Yali等[21]的方法。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 22.0软件进行数据统计、主成分分析（principal component analysis，PCA），显著性分析采用邓肯氏多重比较法，采用Pearson相关性分析，采用Origin 8.0软件做图。

2 结果与分析

2.1 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中褐变程度的影响

图 1 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中褐变的控制效果Fig. 1 Effect of UV-C on browning index of fresh-cut apples during storage

鲜切苹果贮藏期间的褐变程度用褐变指数表示，褐变指数值越大表示褐变程度越严重。如图1所示，对照组和UV-C处理组鲜切苹果在贮藏过程中褐变指数值均呈现上升趋势，但UV-C处理组样品的褐变指数上升较慢，且在10 d的贮藏过程均显著低于对照组（P＜0.05），说明UV-C处理能够有效控制鲜切苹果贮藏期间的褐变。

2.2 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中·产生速率、H2O2含量的影响

图 2 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中·产生速率（A）及H2O2含量（B）的影响Fig. 2 Effect of UV-C on · production rate (A) and HO content (B)22 of fresh-cut apples during storage

2.3 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中膜脂过氧化的影响

图 3 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中LOX活力（A）及MDA含量（B）的影响Fig. 3 Effect of UV-C on LOX activity (A) and MDA content (B) of fresh-cut apples during storage

LOX能够催化多聚不饱和脂肪酸的过氧化反应，从而启动膜脂过氧化，破坏膜结构与功能[10]。如图3A所示，对照组鲜切苹果贮藏过程中LOX活力呈先上升后下降又上升的波浪式变化，UV-C处理组样品LOX活力变化趋势与对照组相似，但UV-C处理能够延迟LOX活力的升高，且在10 d的贮藏过程中LOX活力显著低于对照组（P＜0.05）。MDA是植物细胞膜膜脂过氧化产物，MDA可使膜中的酶蛋白发生交联、聚合反应，引起细胞膜的损伤和破坏，最终导致细胞膜的区室化功能丧失，从而加快酶促反应的发生[17]。如图3B所示，对照组和UV-C处理组鲜切苹果在贮藏过程中MDA含量逐渐上升，UV-C处理组从贮藏的第6天开始显著低于对照组（P＜0.05）。由此可见，UV-C处理可以抑制鲜切苹果的LOX活力，降低膜脂过氧化程度以及MDA的积累，有助于维持膜结构的完整性，进而控制褐变反应。

2.4 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中抗氧化酶活力的影响

SOD、CAT、APX和GR是植物体内重要的抗氧化酶。研究表明UV-C处理能够提高鲜切紫甘蓝[19]和鲜切石榴[22]的抗氧化酶活力。UV-C处理对鲜切苹果抗氧化酶活力的影响如图4所示，对照组和UV-C处理组鲜切苹果在贮藏过程中SOD活力均呈先下降后上升的趋势，在贮藏第4天时活力最低（图4A）。UV-C处理组样品SOD活力在贮藏4～10 d内均显著高于对照组（P＜0.05）。如图4B所示，对照组鲜切苹果贮藏过程中CAT活力呈逐渐下降趋势，UV-C处理能减缓鲜切苹果CAT活力下降，当贮藏至第10天时，与第0天相比，对照组鲜切苹果的CAT活力下降了62.34%，而UV-C处理组样品CAT活力仅下降了10.86%。UV-C处理对鲜切苹果APX和GR活力的影响分别如图4C、D所示，二者在贮藏过程中均呈先上升后下降的趋势，在贮藏第2天时达到最大值，UV-C处理能够显著提高鲜切苹果APX和GR的活力。上述研究结果表明，UV-C处理能够提高鲜切苹果贮藏过程中抗氧化酶的活力，这样有助于及时清除因机械损伤和组织氧化而产生的过量ROS，对延缓鲜切苹果氧化损伤及组织褐变具有积极作用。

图 4 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中SOD（A）、CAT（B）、APX（C）和GR（D）活力的影响Fig. 4 Effect of UV-C on SOD (A), CAT (B), APX (C) and GR (D)activities of fresh-cut apples during storage

2.5 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中VC含量的影响

图 5 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中VC含量的影响Fig. 5 Effect of UV-C on vitamin C content of fresh-cut apples during storage

VC是鲜切水果中重要的抗氧化物质，具有清除ROS的能力，同时，在VC-谷胱甘肽循环中，APX以VC为基质将H2O2转化为H2O[23]。如图5所示，对照组和UV-C处理组鲜切苹果的VC含量在贮藏过程中均逐渐下降，但UV-C处理组样品VC含量在贮藏10 d内均显著高于对照组，UV-C处理能够有效抑制VC在鲜切苹果贮藏过程中的氧化损失，更好地保持其抗氧化能力，保护细胞组织免受氧化损害而延缓果实衰老。

2.6 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中抗氧化能力的影响

图 6 UV-C处理对鲜切苹果贮藏过程中DPPH自由基（A）和ABTS阳离子自由基（B）清除能力以及FRAP（C）的影响Fig. 6 Effect of UV-C on DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activities and reducing power (C) of fresh-cut apples during storage

UV-C处理对鲜切苹果抗氧化能力的影响分别采用ABTS阳离子自由基和DPPH自由基清除能力、FRAP 3 种方法来评价。如图6A、B所示，对照组和UV-C处理组鲜切苹果对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除能力在贮藏过程中均呈下降趋势，UV-C处理组样品对ABTS阳离子自由基的清除能力在贮藏后期（6～10 d）下降速率减慢，清除能力显著高于对照组；而对DPPH自由基的清除能力在贮藏10 d过程中均显著高于对照组（P＜0.05）。对照组鲜切苹果的FRAP在贮藏过程也呈下降趋势，但经UV-C处理后，贮藏前8 d鲜切苹果的FRAP无显著变化，且显著高于对照组（图6C），随后急剧下降，贮藏至第10天时，与对照组无显著差异（P＞0.05）。UV-C处理能够不同程度地减缓鲜切苹果贮藏期间对ABTS阳离子自由基和DPPH自由基的清除能力以及还原能力的下降。同时，研究表明UV-C处理可以提高多种鲜切果蔬的抗氧化能力[24-27]，抗氧化能力的升高在一定程度上提高了鲜切果蔬的ROS代谢能力，从而减轻ROS对组织产生的氧化损伤。

2.7 PCA结果

图 7 鲜切苹果贮藏过程中褐变指数及ROS代谢相关指标的PCA（A）及综合得分（B）Fig. 7 Principal component analysis (A) of BI, ROS metabolismassociated indices and comprehensive scores (B) of fresh-cut apples during storage

PCA是多元统计中的一种数据挖掘技术，其将多个变量的信息综合到较少的几个变量上，这些新的变量即为主成分[28]。对UV-C处理组和对照组鲜切苹果贮藏过程中褐变指数及ROS代谢相关指标进行PCA，结果表明主成分1贡献率为72.03%，主成分2贡献率为15.40%，累积贡献率达到87.43%；因此，可将以上13 个测定指标综合成2 个主成分。如图7A所示，第一主成分与VC含量、FRAP、ABTS阳离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、APX和CAT活力呈正相关，与·产生速率、H2O2和MDA含量呈负相关；第二主成分与SOD活力呈正相关，与LOX活力呈负相关。以第一主成分为X轴，第二主成分为Y轴建立的主成分载荷、得分综合坐标系，可反映随贮藏时间延长，鲜切苹果的ROS代谢总体趋势，即位于X轴右方和Y轴上方表示酶与非酶抗氧化能力较强，而位于X轴左方以及Y轴下方表示ROS积累较多，氧化损伤程度较深。与对照组相比，UV-C处理组样品主要位于X轴右方和Y轴上方，由此可见，UV-C处理后样品具有较强的抗氧化能力，而对照组样品在贮藏过程中氧化损伤较严重。通过计算综合得分（图7B），整个贮藏期间，对照组和UV-C处理组的鲜切苹果综合得分呈逐渐下降趋势，说明鲜切苹果的ROS代谢能力逐渐下降，但UV-C处理可显著减缓下降速率，并且综合评分始终高于对照组。进一步说明UV-C处理能够提高鲜切苹果的抗氧化能力，使ROS代谢畅通，从而减少ROS的积累，减轻氧化损伤。

表 1 褐变指数与·产生速率、H2O2含量、MDA含量以及酶与非酶抗氧化能力的相关性分析Table 1 Pearson correlation coef fi cients of BI, · production rate, HOcontent, MDA content, enzymatic and non-enzymatic antioxidants and 22 antioxidant capacities of fresh-cut apples during storage

表 1 褐变指数与·产生速率、H2O2含量、MDA含量以及酶与非酶抗氧化能力的相关性分析Table 1 Pearson correlation coef fi cients of BI, · production rate, HOcontent, MDA content, enzymatic and non-enzymatic antioxidants and 22 antioxidant capacities of fresh-cut apples during storage

注：*.显著相关（P＜0.05），**.极显著相关（P＜0.01）。

指标 褐变指数 O2-·产生速率 1.000 0.903** 0.245 -0.780** -0.890** -0.733** 0.045 0.888** -0.961** -0.924** -0.902** -0.909**H2O2含量 1.000 0.371 -0.939** -0.742** -0.715** -0.239 0.799** -0.867** -0.920** -0.721** -0.816**SOD活力 1.000 -0.417 0.058 -0.599* -0.614* 0.348 -0.187 -0.440 -0.281 -0.252 APX活力 1.000 0.588* 0.725** 0.381 -0.772** 0.730** 0.855** 0.616* 0.736**CAT活力 1.000 0.573 -0.362 -0.782** 0.877** 0.692* 0.801** 0.806**GR活力 1.000 0.090 -0.848** 0.746** 0.760** 0.806** 0.798**LOX活力 1.000 0.066 -0.113 0.191 -0.168 -0.129 MDA含量 1.000 -0.847** -0.895** -0.822** -0.913**DPPH自由基清除能力 1.000 0.888** 0.929** 0.950**ABTS阳离子自由基清除能力 1.000 0.798** 0.908**FRAP 1.000 0.901**VC含量 1.000-·产生速率 H2O2含量 SOD活力 APX活力 CAT活力 GR活力 LOX活力 MDA含量 DPPH自由基清除能力 ABTS阳离子自由基清除能力 FRAP VC含量褐变指数 1.000 0.924** 0.845** 0.107 -0.721** -0.829** -0.606* 0.071 0.829** -0.955** -0.903** -0.831** -0.929**O2

2.8 相关性分析结果

3 讨 论

鲜切水果的酶促褐变是一个复杂的过程，一般认为鲜切处理使水果组织结构和细胞空间区域化丧失，使原来的PPO与底物多酚的分区定位遭到破坏，导致酶与底物接触，诱发了酶促褐变反应[29-30]；同时，切割带来的机械损伤也会诱导产生大量的ROS，例如·和H2O2，过量的ROS会攻击细胞膜脂，导致膜脂过氧化加剧，使膜透性增大，破坏酚-酚酶的区域性结构，进而加剧酶促反应的发生[31]。本研究中，鲜切苹果的·产生速率和H2O2含量分别从贮藏0、2 d后开始升高，说明其体内ROS代谢系统的平衡逐渐被破坏，不断产生ROS。而膜脂过氧化产物MDA含量也在贮藏过程中升高，表明随着贮藏时间的延长，鲜切苹果的细胞膜完整性逐渐被破坏，相关性分析结果显示鲜切苹果的MDA含量与·产生速率以及H2O2含量呈显著正相关。UV-C处理组鲜切苹果贮藏期间ROS和MDA含量显著低于对照组，结合PCA结果，显示对照组样品贮藏过程中氧化损伤程度高于UV-C处理组样品，说明UV-C处理可减少鲜切苹果ROS的积累，抑制膜脂质过氧化的发生，从而维持膜的完整性，保持细胞空间的区域化，进而延缓褐变反应的发生。同时，相关性分析结果显示鲜切苹果褐变程度（褐变指数）与ROS和MDA含量呈极显著正相关，进一步证实了鲜切苹果的褐变与ROS代谢密切相关，即UV-C处理通过调节ROS代谢控制鲜切苹果的褐变。

ROS的大量积累会加剧鲜切苹果的酶促褐变，但水果体内具有一套完整的抗氧化酶防御系统，包括SOD、CAT、APX、GR等[32]，可以有效清除ROS，减缓氧化损伤。本研究中鲜切苹果的CAT、APX和GR活力在贮藏的前2 d内升高，随后逐渐下降。研究表明机械损伤初期诱导产生的ROS可以作为一种信号分子上调防御系统来抵御逆境伤害[33]；因此，鲜切苹果贮藏初期产生的ROS可能作为信号分子诱导CAT、APX和GR活力提高，但是SOD活力在贮藏初期逐渐下降，可以推测在鲜切苹果中CAT、APX和GR对ROS的清除作用要大于SOD，相关性分析也显示CAT、APX和GR活力与ROS水平呈极显著负相关。随着贮藏时间的延长，ROS水平逐渐上升，ROS积累引起的氧化胁迫导致鲜切苹果代谢失调，使CAT、APX和GR对ROS的清除能力减弱，从而加剧了氧化损伤[35]。与之相反的是，SOD活力在贮藏4 d后逐渐升高，SOD的主要功能是清除·；因此在贮藏后期（6 d以后）·产生速率逐渐减缓。UV-C处理能够提高鲜切苹果SOD、CAT、APX和GR活力，在贮藏过程中这4 种抗氧化酶活力均显著高于对照组样品，相关性分析显示鲜切苹果抗氧化酶（除SOD）活力与褐变指数呈负相关（r＝-0.606～-0.721）；因此，可以推测UV-C处理通过提高鲜切苹果的抗氧化酶活力，缓解由ROS引起的氧化损伤，进而控制贮藏过程中的褐变反应。

DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力和FRAP是评价非酶抗氧化能力常见的3 种方法。在贮藏过程中鲜切苹果对自由基的清除能力以及FRAP逐渐减弱，抗氧化防御系统功能的下降加剧了鲜切苹果的褐变。相关性分析显示鲜切苹果的抗氧化能力与褐变指数呈极显著负相关（r＝-0.831～-0.955）。同时，许多研究表明鲜切水果的抗氧化能力与VC含量相关[17,32,35]，这与本研究相关性分析结果一致：鲜切苹果的抗氧化能力（DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力和FRAP）与VC含量呈显著正相关。UV-C处理能够提高鲜切苹果的VC含量以及抗氧化能力；由此可见，UV-C处理组样品中较高的VC含量使其具有较强抗氧化能力，从而加速ROS代谢，缓解ROS对鲜切苹果产生的氧化损伤。

综上所述，UV-C处理通过提高鲜切苹果的抗氧化防御系统（酶和非酶抗氧化能力），维持细胞内ROS的代谢平衡，减少ROS的积累，从而降低了ROS对组织产生的氧化损伤，保持膜的完整性，延缓PPO与酚类物质的反应，进而控制褐变。