黄芩苷灌胃对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制

欧红令，林亚发，林小亮

(海口市第四人民医院，海口 571100)

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌实质或间质的局限性或弥漫性炎症损伤的一种常见的心血管疾病[1]。目前认为柯萨奇病毒B3型(CVB3)是病毒性心肌炎的主要致病因素之一，严重者可导致心力衰竭的发生，甚至出现不良事件[2,3]。一项基础研究证实，CVB3感染小鼠心肌细胞凋亡持续存在[4]。另有研究证实，病毒性心肌炎猝死患者尸检标本较意外猝死患者心肌细胞凋亡率高出数倍[5]。因此，抑制病毒性心肌炎患者心肌细胞凋亡、逆转心室重构，可能是延缓病毒性心肌炎患者病程进展的有效途径。黄芪总黄酮是中药黄芪的有效成分之一，可明显抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞由于内质网应激所致的凋亡，并明显改善小鼠血流动力学指标[6]。黄芩苷是唇形植物黄芩的有效成分之一，其具有抗凋亡、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、调节免疫等多种生物学作用[7]。黄芩苷的抗凋亡作用已经被国内外研究证实，但是其对心肌细胞的凋亡作用却鲜有报道。2017年12月～2018年2月，本实验采用黄芩苷灌胃病毒性心肌炎小鼠，并观察小鼠心室重构、心肌细胞凋亡率及细胞线粒体凋亡通路的变化，探讨黄芩苷对病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器 黄芩苷(江北药业，纯度≥98%)；CVB3(Nancy株)购于吉林大学农牧学院实验动物中心病毒室，病毒原液效价为1×10-3TCID50/L；黄芪总黄酮(齐鲁制药有限公司)；氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)试剂盒(上海晶抗生物工程公司)；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(美国Invitrogen公司)；Caspas-9、Caspas-3活性检测试剂盒及细胞色素C抗体(美国Biovision公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，英国Abcam公司)；Caspase-9、Caspase-3抗体(中国博士德公司)。

1.2 实验动物来源、模型制备及分组 60只雄性Balb/c小鼠，SPF级，4周龄，体质量13～15 g，购自吉林大学基础医学院动物实验中心，动物合格证号SCXK(吉)2011-0004。本实验经过海口市第四人民医院动物伦理委员会批准，符合其指导原则。将60只Balb/c小鼠随机分为对照组，病毒性心肌炎组，黄芩苷低、中、高剂量组及黄芪总黄酮组，各10只。后五组于腹腔内无菌注射0.1 mL内含1×102TCID50 CVB3病毒液[8](1次/d，连续3 d)。黄芩苷低、中、高剂量组同时给予20、50、100 mg/(kg·d)灌胃[9]，1次/d，连续10 d。黄芪总黄酮组同时给予给予黄芪总黄酮0.35 mg/(kg·d)腹腔注射[8]，1次/d，连续10 d。对照组仅给予等体积0.9% NaCl溶液腹腔注射，1次/d，连续10 d。

1.3 心功能检测 实验第11天，运用彩色超声显像仪检测各组小鼠心脏功能指标，包括左心室舒张末径(LVIDd)、左心室收缩末径(LVESd)、左心室射血分数(LVEF)。首先采用10%水合氯醛0.2 g/kg腹腔注射麻醉小鼠，备皮，将麻醉好的小鼠仰卧于超声诊床上，使用高频探头，测定上述心功能指标，每个指标取4个完整心动周期的测量平均值。

1.4 血清NT-proBNP水平检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)。实验第11天，抽取各组小鼠腹主动脉动脉血5 mL，4 000 r/min离10 min，分别取上清液置于-80 ℃冰箱保存，静置7 d检测血清中NT-proBNP水平，实验步骤严格按照ELISA法检测说明书执行。

1.5 心室肌细胞凋亡率测算 采用流式细胞仪。制备单细胞悬液：实验第11天，各组分别取等体积心室肌组织，剪碎，胰酶消化20～25 min，取上清液，加入小牛血清终止消化；沉淀重复上述步骤，如此反复实验几次，用300目尼龙网过筛去掉较大团块；低速(500 r/min)离心5 min，弃上清。沉淀加入生理盐水，离心5 min，弃上清；重复3次，制成单细胞悬液，调整细胞的浓度为3×106个/mL；取100 μL的细胞悬液加入1 mL的碘化丙啶，配成50 μg/mL液体(含RNA酶10 mg)，20 ℃避光保存，20 min后测定心肌凋亡指数；氩离子激光作为光源，于630 nm波长的光下，线形方式获取细胞；在Celquest下进行分析，数据采用Macintosh系统进行处理，凋亡率为第二象限+第四象限所占细胞比例。

1.6 心室肌细胞线粒体膜电位检测 采用流式细胞仪。单细胞悬液制作步骤同上。操作步骤严格按JC-1染色试剂说明书进行，送流式细胞工作室检测。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，发出强烈的红色荧光(Ex=585 nm，Em=590 nm)；当线粒体膜电位下降或丧失时，JC-1只能以单体的形式存在于胞质中，产生绿色荧光(Ex=514 nm，Em=529 nm)。线粒体膜电位的变化通过红/绿荧光强度的率来衡量，独立重复实验3次，取均值。

1.7 心室肌细胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表达检测 采用Western blotting法。提取各组小鼠心室肌细胞蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，制备上样液。取各组待测样品20 μL和5 μL蛋白标记，加至SDS-PAGE电泳装置中，进行电泳，转膜后脱脂牛奶封闭2 h，加入相应一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，缓冲液洗膜3次，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，缓冲液洗膜3次，化学发光显像，暗室曝光，扫描胶片，用凝胶图象处理系统分析。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的灰度值/内参GAPDH的灰度值。

1.8 心室肌细胞Caspase-9、Caspase-3活性检测 单细胞悬液制备步骤同上。操作步骤严格按Caspase-9、Caspase-3活性检测试剂盒说明书进行，独立重复实验3次，取均值。

2 结果

2.1 各组小鼠心功能比较 见表1。

表1 各组小鼠心功能比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与病毒性心肌炎组相比，#P<0.05；与黄芩苷低剂量组相比，▲P<0.05；与黄芩苷中剂量组相比，△P<0.05。

2.2 各组小鼠血清NT-proBNP水平比较 对照组、病毒性心肌炎组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组血清NT-proBNP水平分别为(114.25±12.71)、(375.66±44.45)、(328.10±44.85)、(268.55±32.15)、(183.65±27.48)、(236.57±35.44)ng/L，病毒性心肌炎组与对照组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组相比，P均<0.05。

2.3 各组小鼠心室肌细胞凋亡率比较 对照组、病毒性心肌炎组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组心室肌细胞凋亡率分别为4.7%、27.0%、21.0%、14.5%、8.6%及12.5%，病毒性心肌炎组与对照组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组相比，P均<0.05。

2.4 各组小鼠心室肌细胞线粒体膜电位水平比较 对照组、病毒性心肌炎组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组心室肌细胞线粒体膜电位分别为100.00±0.02、40.32±4.81、50.35±6.85、72.34±10.08、84.58±18.74、78.45±14.37，病毒性心肌炎组与对照组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷中剂量组、黄芩苷高剂量组及黄芪总黄酮组相比，P均<0.05。

2.5 各组小鼠心室肌细胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表达比较 见表2。

表2 各组小鼠心室肌细胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3表达比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与病毒性心肌炎组相比，#P<0.05；与黄芩苷低剂量组相比，▲P<0.05；与黄芩苷中剂量组相比，△P<0.05。

2.6 各组小鼠心室肌细胞Caspase-9、Caspase-3活性比较 见表3。

表3 各组小鼠心室肌细胞Caspase-9、Caspase-3活性比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与病毒性心肌炎组相比，#P<0.05；与黄芩苷低剂量组相比，▲P<0.05；与黄芩苷中剂量组相比，△P<0.05。

3 讨论

病毒性心肌炎是一类常见的感染性心肌炎性疾病，临床表现形式多样，病程长短不一，部分急性患者可发展为慢性病毒性心肌炎或者扩张型心肌病，最终发展为充血性心力衰竭，猝死率高达10%～44%[10]。近年来国内外学者通过建立CVB3感染小鼠建立病毒性心肌炎模型及临床大量病例分析证实，在病毒性心肌炎进展中，心肌细胞的凋亡对疾病的转归起着十分重要的作用[11]。本研究采用CVB3病毒制备病毒性心肌炎小鼠模型，给予不同剂量黄芩苷灌胃进行干预，明确药物的剂量效应关系。研究发现，病毒性心肌炎组小鼠心肌细胞凋亡明显，而黄芩苷低、中、高剂量组均可有效降低病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡率、改善LVESd、LVIDd、LVEF等心室重构指标、降低血清NT-proBNP水平，且黄芩苷高剂量组较中、低剂量组改善趋势更加明显。证实小剂量黄芩苷即可通过抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡，保持有效工作心肌细胞数量，达到逆转心室重构的作用，进而缓解病毒性心肌炎小鼠的心力衰竭状态，改善其心脏功能，而黄芩苷灌胃在安全剂量内，随剂量的增加保护作用愈加明显。

线粒体是细胞能量产生的最重要细胞器，许多因素可以介导线粒体功能障碍，诱导细胞凋亡，其中，线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞凋亡的经典通路之一[12]。Bielaszewska等[13]研究发现，在细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性发生改变，线粒体基质渗透压升高，引发线粒体膜电位下降的同时，促使线粒体膜间隙的Cyt C等凋亡诱导因子释放，触发凋亡级联反应，引起细胞凋亡[14]。为了探索黄芩苷减少病毒心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的机制，本实验采用流式细胞仪检测小鼠心室肌细胞线粒体膜电位。结果发现，病毒性心肌炎组小鼠心室肌细胞线粒体膜电位降低，说明CVB3对小鼠心肌损伤过程中线粒体功能障碍与凋亡密切相关。而黄芩苷低、中、高剂量组小鼠心室肌细胞线粒体膜电位有所改善，其中黄芩苷高剂量组改善最明显。说明黄芩苷减少病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞凋亡可能与减轻线粒体损伤有关，且随着黄芩苷剂量的增加，保护线粒体效果更佳明显。

线粒体损伤发生后会释放Cyt C到胞质中，与多聚化的Apaf-1结合，再与辅因子ATP结合，形成复合体，共同激活Caspase-9形成凋亡体，开启瀑布效应激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡。为了探求黄芩苷改善病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的深层机制，本实验对线粒体Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信号通路的蛋白表达与活性进行检测。研究发现，病毒性心肌炎组小鼠心室肌细胞Cyt C、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达增加，Caspase-9、Caspase-3活性增强；黄芩苷低、中、高剂量组小鼠心室肌细胞Cyt C/Caspase-9/Caspase-3信号通路激活被抑制，Caspase-9、Caspase-3活性降低，其中黄芩苷高剂量组比低、中剂量组抑制趋势更加明显，说明黄芩苷在保护病毒性心肌炎小鼠心肌细胞线粒的同时，抑制了Cyt C /Caspase-9 /Caspase-3凋亡信号通路被激活，且呈剂量依赖性，这可能是黄芩苷抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡、改善心功能的作用机制之一。这虽然可说明黄芩苷治疗病毒性心肌炎的部分作用靶点，但不排除黄芩苷在抑制线粒体凋亡信号通路的同时，对其他凋亡信号通路也具有抑制作用。

综上所述，黄芩苷灌胃可抑制病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡，其机制可能与升高病毒性心肌炎小鼠心肌细胞线粒体膜电位，缓解线粒体损伤，抑制Cyt C/Caspase-9/Caspase-3凋亡信号通路表达与活化有关。