慢性房颤心房肌细胞成分结构的基因本体法分析

曾祥君，肖学钧，吴岳恒，黄焕雷

(1贵州省人民医院，贵阳550002；2广东省心血管病研究所)

房颤易引起心衰、脑卒中等严重并发症,可危及患者生命[1]。因此，探明房颤发病机制并进行药物干预，是房颤临床基础研究的重要方向。20世纪90年代房颤发生的多子波折返学说被提出，2000年左右房颤心房肌钙、钾、钠通道重构被发现，虽然房颤电生理分子基础已被深入揭示，但至今房颤发生的始动因素、细胞结构变化等关键环节仍不清楚。日益发展的生物信息学有助于在分子水平上系统了解房颤心房肌细胞成分结构变化，并对房颤发病机制进行深入探讨。本研究以单病种配对方案行心房肌表达谱基因芯片检测，本体分析法(GO)研究慢性房颤心房肌细胞分子成分异常的整体状态，旨在进一步揭示房颤的发病调控机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年10月～2010年6月在广东省心血管病研究所心外科接受二尖瓣置换术的二尖瓣狭窄为主的48例风湿性心脏病患者，排除合并感染性心内膜炎、糖尿病、冠心病、严重肝肾功能不全、二尖瓣重度反流、术前长时间口服钙通道阻滞剂、风湿活动期、因主动脉瓣病变接受主动脉瓣膜置换及非风湿性心脏病接受二尖瓣置换者。48例患者中慢性房颤24例(慢性房颤组，持续房颤病史大于6个月)，窦性心律24例(窦性心律组)。慢性房颤组男4例、女20例，年龄(47.3±9.2)岁，肺高压(46.2±13.0)mmHg，左心房血栓3例，左心房内径(53.1±7.0)mm，右心房内径(58.6±6.0)mm，左心室内径(48.5±8.2)mm，右心室内径(49.7±6.4)mm，射血分数(62.4±5.5)%，三尖瓣反流面积(6.3±2.9)cm2；窦性心律组男4例、女20例，年龄(44.4±9.2)岁，肺高压(54.2±26.8)mmHg，左心房血栓0例，左心房内径(45.5±4.7)mm，右心房内径(49.5±5.1)mm，左心室内径(44.7±8.5)mm，右心室内径(51.1±7.5)mm，射血分数(66.6±6.1)%，三尖瓣反流面积(3.4±1.8)cm2；两组左心房内径、右心房内径、三尖瓣反流面积比较P均<0.01。手术过程中体外循环插管时获取右心耳心肌，取材后速冻于液氮中保存。建12个样本池，每个样本池放4个样本，两组24对样本随机混入样本池。本研究经医学伦理委员会批准，所有患者术前已签订切除标本可用于科研同意书。

1.2 右心耳组织钙调蛋白(CaM)表达检测 采用Western blotting法。取两组液氮中冻存的右心耳心肌组织各100 mg，加入0.5 mL蛋白裂解液研磨匀浆，离心后得蛋白提取液，经Bradford比色法测蛋白浓度。各取20 μg总蛋白在不连续聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(80 V 30 min，120 V 3 h)，积层胶和分离胶的浓度分别为5%和8%，用半干式电印迹将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上，以1%牛血清白蛋白封闭非特异性结合位点，将膜与兔抗人CaM多克隆抗体、GAPDH多克隆抗体(1∶2 000)4 ℃过夜，洗膜后与二抗(1∶1 000)室温作用2 h，漂洗、显色，光密度扫描仪分析吸光度值。CaM相对表达量=CaM吸光度值/GAPDH吸光度值。

1.3 慢性房颤患者心房肌差异表达基因检测及验证 TRIzol一步法提取两组心房肌总RNA，质检合格，将两组每4个样本RNA等量随机混入一个芯片样本池中，逆转录后与Illumina Human HT-12全基因组表达谱芯片进行杂交，利用Illumina Beadchip Reader扫描获取芯片数据。检索既往文献中应用定量PCR、Western blotting、2-DE、免疫组化等方法明确的慢性房颤患者心房肌异常表达基因或蛋白，印证本实验所获表达谱基因芯片数据的可靠性。采用R&Bioconductor中lumi数据包进行数据的归一化和主成分分析，LIMMA数据包筛选显著性差异表达基因[2]，Mev4.8软件进行系统聚类分析[3]。DIVID软件在线进行细胞成分本体分析[4,5]。

2 结果

2.1 两组右心耳心肌组织CaM表达比较 慢性房颤组、窦性心律组心房肌组织中CaM相对表达量分别为0.199±0.058、0.135±0.034，两组相比P<0.05。该结果与表达谱基因芯片数据一致[CALM3，Fold Change(AF∶SR)=1.32，P=1.10E-06]。

2.2 慢性房颤患者心房肌差异表达基因 检索到一致基因达55个[6～28]，即ACTA2、ANK2、TNNI3、MYH7、FHL2、SOD2、TGFBI、CSRP3、VWF、NPPB、FBLN1、TGFBRAP1、TRAP1、PYGM、ACOT1、TAGLN、PPP2CA、RCAN1、KCNK3、DES、GJA5、KCNJ2、ITPR1、CACNA1C、CTGF、KCNN2、CACNA2D2、CDKN1A、TIMP2、VEGF、PPP1CA、PPP1R1A、GJA1、CAV1、CALM3、CCL2、CDKN1A、CDKN1B、MYL4、OXCT1、KCNK17、TNNT2、HSPB7、PRDX1、TPI1、NDUFV1、HSPB6、ACADVL、PKM2、ENO1、VDAC2、PDGFA、PPP1R12B、MEF2A、HSPB1，其中含本课题组验证的FHL2、CALM3基因，相反基因仅4个[13,25,26,28]，即KCNAB1、KCNIP2、TUBA1B、SMAD4。本课题所获基因芯片数据可靠性较高。

2.3 两组基因芯片数据的主成分和聚类分析结果 lumi主成分分析显示，慢性房颤组与窦性心律组分布在二维空间的不同位置;Mev4.8聚类热图显示，慢性房颤组与窦性心律组分为两个聚类群，表明慢性房颤与窦性心律心房肌基因表达模式明确存在不同。

2.4 慢性房颤心房肌细胞成分本体分析结果 在细胞组件层次上注释到37个具有显著性异常的本体条目，涉及到细胞外区域成分、胶原、细胞膜成分、跨膜蛋白、膜锚蛋白、肌纤维、肌动蛋白细胞骨架、内质网、线粒体、呼吸链、脂粒、脂蛋白颗粒等结构(表1)。显著性检验P<0.05的本体注释条目且富集积分>1.5的聚类簇有4簇(表2)[5]，显示明显受房颤影响的心房肌细胞结构成分依次有细胞外成分、收缩纤维及细胞骨架。

3 讨论

本实验采集接受手术的风湿性心脏病二尖瓣狭窄病变为主患者右心耳样本，利用基因芯片技术检测慢性房颤基因表达谱改变，基因本体方法分析表明,房颤心房肌多种细胞组件发生结构变化，明显受房颤影响的心房肌细胞结构成分依次有细胞外成分、收缩纤维及细胞骨架。

鉴于临床上患者病情的复杂性，为尽量减少干扰因素，实验严格按排除条件采集了风湿性心脏病二尖瓣狭窄为主单病种标本，并以年龄、性别、体质量、左心房大小、三尖瓣反流程度兼顾肺动脉压力配对分为慢性房颤组和窦性心律组。两组年龄、性别、肺高压程度、左心室内径、右心室内径及射血分数比较无统计学差异，具有可比性。慢性房颤组左心房内径、右心房内径及三尖瓣反流面积增大并合并左心房血栓3例，临床观察证实左心房增大、容易合并左心房血栓是房颤患者固有特征。本课题所获基因芯片数据与既往研究结果一致性较高，主成分分析和系统聚类分析显示，慢性房颤组和窦性心律组明显区分为两类，表明房颤心房肌存在明确的基因表达模式。

LIMMA算法筛选到显著性差异表达基因272条，DIVID软件行细胞组件本体分析。结果显示，在细胞组件层次上有37个显著性差异分类，慢性房颤心房肌在细胞外基质、胶原、细胞基底膜、细胞膜、细胞器内膜、细胞膜锚蛋白、细胞内囊泡、膜结合囊泡、细胞质囊泡、线粒体、呼吸链、内质网、内质网腔、收缩纤维、肌原纤维、肌小节、I带、A带、Z盘、M线、肌球蛋白复合体、肌球蛋白丝、平滑肌收缩纤维、肌动蛋白细胞骨架、富甘油三酯脂蛋白颗粒、很低密度脂蛋白颗粒、脂肪颗粒等结构较窦性心律心房肌出现明显异常。该细胞组件本体分析全面描述了房颤心房肌细胞结构改变并给出了一些新的信息，譬如囊泡、脂蛋白颗粒、细胞骨架等早前关注较少的结构[29～31]。

表1 慢性房颤心房肌差异表达基因在细胞成分本体的富集

表2 显著富集的GO注释条目聚类

房颤心房肌在光镜下可见细胞肥厚，胞质内空泡及细胞间隙纤维化等病理改变，电镜下可见Z盘损耗、线粒体聚集、糖原颗粒堆积、染色质分布异常及肌浆网减少等超微结构改变。本实验通过细胞组件基因注释和定位，显示分子水平异常与细胞病理变化具有一致性。在细胞组件层次上对显著性异常的本体注释条目进行聚类富集，进一步显示心房肌结构受房颤影响最剧烈的依次为细胞外成分、收缩纤维及细胞骨架：①胞外改变除了胶原堆积形成间质纤维化外，基底膜、胞外蛋白成分同样存在异常；②包括已观察到的Z盘损耗在内，肌纤维中I带、A带、M线、肌小节等在分子水平均有异常；③肌球蛋白丝、微管等细胞骨架分子结构存在异常。

关于房颤心房肌的分子病理研究，既往多关注单个基因的变化，本实验以表达谱基因芯片技术观察慢性房颤与窦性心律心房肌全基因组表达变化，获得较为详细可靠的慢性房颤状态心房肌基因整合信息，展示出多基因变化协同性，揭示了房颤对心房肌细胞成分分子结构的主要影响，为进一步揭示房颤的分子发病机制奠定了基础。