下调IGF-1R对人肺腺癌A549细胞吉非替尼耐药性的影响

刘俊，宁兰兰，赵子文，马为，王汉平，徐邦牢

(广州医科大学附属广州市第一人民医院，广州510180)

肺癌是一种常见恶性肿瘤，在我国呈现出高发病率和高致死率的流行病学和临床特征，严重威胁了我国居民的健康并造成严重的社会经济负担。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，患者预后较差[1]。近年来，以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的分子靶向治疗在晚期NSCLC治疗中取得了重大进展，然而患者易出现耐药。进一步研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)发生耐药的机制十分重要。吉非替尼是一种选择性EGFR-TKIs，可阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成，并增加肿瘤细胞的凋亡[2]。国内外有关研究[2～8]显示，在吉非替尼耐药的NSCLC细胞中胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)信号通路被激活，提示IGF-1R可能影响NSCLC细胞对吉非替尼的耐药性。2016年1月～2017年7月，本研究拟通过构建下调IGF-1R表达的人肺腺癌A549细胞株，观察其对吉非替尼耐药性的影响，为预测患者对EGFR-TKIs产生耐药提供可能性的检测指标。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肺腺癌细胞株A549购自美国ATCC公司。siRNA构建试剂盒(广州辉骏生物科技有限公司)；RNA iso Plus试剂盒(日本TaKaRa公司)；real-time PCR相关试剂盒(上海基尔顿生物科技有限公司)；相关Western blotting一抗及二抗(美国Cell Signaling Technology公司)；CCK-8试剂盒(上海前尘生物科技有限公司)。

1.2 建立吉非替尼耐药细胞株A549/GR 以人肺腺癌细胞株A549为亲本细胞，体外采用低浓度逐步加量诱导法建立吉非替尼耐药细胞株A549/GR(阳性对照组)。即在亲本细胞中，每天逐渐增加吉非替尼浓度培养，第1天0.5 μmol/L、第2天1 μmol/L、第3天1.5 μmol/L、第4天2 μmol/L，连续培养4 d，后续一直用2 μmol/L吉非替尼培养，直至加入吉非替尼后，细胞不再出现死亡时表示成功建立了吉非替尼耐药细胞株A549/GR。将其用于吉非替尼处理后的细胞活力的阳性对照。

1.3 构建靶向IGF-1R的siRNA 选择3条siRNA序列和1条随机对照序列。慢病毒载体构建siRNA，分别设计4对引物(IGF-1R-siRNA1、IGF-1R-siRNA2、IGF-1R-siRNA3、NC-siRNA)并进行体外构建。取4只Wistar大鼠，于大鼠尾静脉处使用微量注射器取分别注射6 μL含有上述四种siRNA的病毒稀释液[9]。72 h后，分离4只大鼠肠道组织，利用RNA iso Plus试剂盒提取肠道组织中总RNA，经逆转录成cDNA，随后利用real-time PCR检测上述分离的肠道组织中细胞内IGF-1R mRNA的表达。感染3条特异性针对IGF-1R的siRNA(IGF-1R-siRNA1、IGF-1R-siRNA2、IGF-1R-siRNA3)与感染阴性对照序列NC-siRNA比较，其肠道组织中IGF-1R mRNA相对表达量分别为(73.2±4.8)%、(32.1±2.7)%、(56.5±3.6)%，IGF-1R-siRNA2的IGF-1R mRNA相对表达量最低，选择进行后续实验，同时将其命名为IGF-1R-siRNA。

1.4 IGF-1R siRNA转染A549细胞 取6孔培养板，接种2 mL细胞密度为4×104个/mL的A549细胞，用含10%胎牛血清的培养基，于37 ℃、5% CO2状态孵育箱培养24 h。当细胞生长融合达90%时，按照转染细胞试剂盒说明书操作。将选中的IGF-1R-siRNA和NC-siRNA分别与转染试剂混合，上下吹打5遍，室温下放置15 min以形成转染复合体后从培养板中小心吸出生长培养基，再加入300 μL含10%胎牛血清生长培养基，随后分别加入至细胞中，轻轻转动培养板使转染复合体均匀分布，继续培养48 h。得到转染IGF-1R siRNA细胞(实验组)及NC-siRNA细胞(阴性对照组)。

1.5 IGF-1R mRNA表达检测 采用real-time PCR法。用RNA iso Plus试剂盒提取1.4实验组、阴性对照组细胞样品，根据试剂盒说明书提取和纯化总RNA，用反转录试剂盒逆转录得到相应的cDNA，作为PCR反应的模板。其中用于检测IGF-1R表达的PCR上游引物为5′-TGCCCCACTCTACTTCCCTG-3′，下游引物为5′-GGCGGTCTTAGCCTCTTCTGT-3′。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。用β-actin作为内参基因，并采用2-ΔΔCt法分析IGF-1R mRNA的相对表达量。

1.6 IGF-1R蛋白表达检测 采用Western blotting法。取1.4实验组、阴性对照组细胞，加入蛋白裂解液(其中RIPA∶PMSF=99∶1)，置于冰上充分匀浆，离心后取上清。用BSA法进行蛋白定量，上样量约为40 μg/μL，电泳1 h后，湿转法2 h，5%脱脂牛奶封闭，一抗(1∶1 000)孵育过夜(4 ℃)，TBST清洗3～5遍后，加入二抗(兔抗鼠，1∶10 000，4 h)。经TBS-T洗脱后，将PVDF膜置于吸水纸上吸干水分，均匀孵育化学发光液，进行显影操作。根据显影情况适当调整曝光时间，用Gene Snap进行图像拍摄，随后可使用Photoshop软件对蛋白采取半定量分析。目的蛋白的相对表达量为目的蛋白积分光密度/β-actin积分光密度。

1.7 细胞活力测算 采用CCK-8比色法。取实验组、阴性对照组、阳性对照组细胞，且每组检测4个时间点(0、12、24、48 h)的细胞活力，每个时间点设3个复孔。取生长状态良好的3组细胞，接种于96孔板，细胞密度为1×104个/孔。37 ℃、5% CO2孵育箱中培养24 h，细胞单层铺满孔底。此时，每孔加入终浓度为2 μmol/L吉非替尼进行培养，记为0 h。随后，再继续培养的12、24、48 h。在每个时间点时，每孔加入10 μL CCK-8，继续孵育1 h后，用酶标仪分别测定每孔细胞在450 nm处的光密度值。以阳性对照组细胞光密度值的平均值对应的细胞活力为100%，将实验组和阴性对照组各时间点每孔的光密度值与阳性对照组的光密度值平均值相比，计算得到各孔相对的细胞活力。

2结果

2.1 两组细胞IGF-1R mRNA及蛋白表达比较 实验组、阴性对照组IGF-1R mRNA相对表达量分别为(31.7±2.5)%、(125.4±5.3)%，蛋白相对表达量分别为(27.4±3.5)%、(80.5±5.2)%，两组比较P均<0.05。

2.2 两组细胞活力比较 见表1。

表1 两组细胞活力比较

注：与阴性对照组相比，*P<0.01。

3 讨论

很多实体瘤组织中的EGFR表达增高，抑制EGFR活性成为治疗一些实体瘤的策略[10～15]。临床上使用的吉非替尼是一种EGFR特异性抑制剂，在治疗局部晚期或转移性NSCLC有明显治疗效果的同时，也使许多肺癌患者的肿瘤细胞出现严重耐药[2,16,17]。有研究认为，IGF-1R信号通路的活化与吉非替尼耐药性的产生有关[5]。Patel等[17]则认为吉非替尼对于EGFR蛋白家族T970M型突变较为敏感。上述研究结果提示，在一些实体瘤中，IGF-1R和EGFR的作用相似。本研究的理论基础与几篇研究[18,19]类似。本研究通过下调IGF-1R探究其对吉非替尼耐药性的影响，确认了IGF-1R是吉非替尼引起耐药性的部分原因。

本研究结果发现，下调IGF-1R的表达可显著性增强人肺腺癌A549细胞对吉非替尼的敏感度，降低吉非替尼处理后的细胞活力。这提示，IGF-1R相关通路可能激活或增强EGFR的表达，而细胞加强对EGF等胞外生长因子的获取，减弱吉非替尼的药效，促进肿瘤生长。下调IGF-1R可能相对应减弱EGFR的表达，而细胞对胞外生长因子不敏感，增强对吉非替尼的敏感度。因此，后续可研究IGF-1R通路与EGFR之间的调控关系，更进一步明确EGFR作为肺癌的治疗靶点，也可增加IGF-1R作为肺癌治疗的靶点。本研究为患者对EGFR-TKIs产生耐药提供可能性的检测指标，对进一步寻找IGF-1R高选择性抑制剂具有重要的临床意义和应用前景。也可以在未来治疗肺癌中联合使用吉非替尼和IGF-1R抑制剂，或者在治疗其他肿瘤中联合使用EGFR-TKIs和IGF-1R抑制剂，期望可达到更好的治疗效果。

IGF-1R和EGFR蛋白结构类似，都是跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，可促进细胞分裂增殖[20]。这为设计特异性针对IGF-1R的抑制剂提供了很多重要的参考。除IGF-1R外，其他和EGFR及IGF-1R结构类似的信号通路分子，也可能作为后续研究吉非替尼耐药性的靶点。因为很多药物的设计是针对特定结构域位点，但很多蛋白结构类似，这样也会有脱靶的出现。因此，药物的特异性可能还需进一步的优化，以期待可解决药物特异性和耐药性的问题，更好地治疗疾病。