无机硒肥对土壤有效氮含量及菠菜品质的影响

史雅静，史雅娟，王玉荣，王慧敏，秦礼凯

（1 辽宁科技学院生物医药与化学工程学院/辽宁省生物医药与化学工程重点实验室，辽宁本溪 117004；2 中国科学院生态环境研究中心/城市与区域国家重点实验室，北京 100085）

硒被公认为人类和动物必需的微量营养素，具有防癌抗癌、清除体内自由基、抗衰老等多种功能[1-2]，据估计全球约有10亿人口硒摄取量不足[3]。因此，适量补硒是增强人体健康、防治疾病和延年益寿的有效措施，而食用富硒植物吸收硒元素仍然是人体补硒的有效途径[4-6]。生产上常用亚硒酸钠 (Na2SeO3)作为富硒植物的无机硒肥，施加的剂量因施肥方式不同而异。有研究显示，采用喷施、浸泡作物等方式施肥的Na2SeO3浓度一般在2～15 mg/kg范围[7-8]，土壤中施Na2SeO3浓度一般在0.25～5 mg/kg范围[9-10]。多年来，在富硒生产中人们更多关注的是植物从根部、叶面将外源硒吸收转化为可食部分的转化率，这决定了作物的富硒效果[7,11-13]，并成为富硒生产的关键，而在硒肥对富硒作物其他营养品质的影响方面关注却较少。

目前，国内外学者已开展了Na2SeO3对土壤中微生物代谢能力，植物吸收、转运硒、促进作物生长能力等方面的研究[7,14-17]，认为施加适量Na2SeO3对土壤酶活性、微生物的数量会产生一定影响，可以促进植物生长发育，进而提高作物产量[4,18-20]。但Na2SeO3对土壤氮素代谢影响研究还不够完善，并且缺少Na2SeO3在土壤中被根部吸收并转化为作物品质的路径的综合分析。因此，本研究选取常见蔬菜—菠菜作为栽培植物，选用3个与富硒生产接近的Na2SeO3浓度，研究不同浓度Na2SeO3对土壤有效氮含量、脲酶活性，以及菠菜硝酸盐、维生素C、可溶性蛋白、可溶性糖含量等指标的影响，综合分析Na2SeO3在土壤中被根部吸收、转化的可能路径，为生物强化生产富硒农产品及调控硒的安全水平提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菠菜 (Spinacia oleraceaL.)为小尖叶本地土菠菜，青县艾森蔬菜良种推广中心生产。

供试土壤采自山东省淄博市清洁自然土壤，以多点取样法采集表层0—30 cm深的土壤，自然风干，研磨后过2 mm筛。土壤基本理化性质为pH值7.34，粘粒28.9%，有机质含量5.73 g/kg，全氮含量0.650 g/kg，总硒含量0.790 mg/kg。

供试有机肥 (总氮0.86%，有机碳73.12%) 主要为通过赤子爱胜蚓 (Eisenia foetida) 处理有机固体废弃物 (秸秆∶菇渣∶牛粪=3∶2∶1) 后制成的蚓粪有机肥。

供试亚硒酸钠 (Na2SeO3) (分析纯，纯度 ＞ 98%)为沈阳化学试剂厂生产。

1.2 试验设计

采用盆栽试验，设4个处理为每千克土施用亚硒酸钠0 (CK)、1、10、30 mg，每个处理10个重复。具体试验方法为：选择内径18 cm、深度15 cm的塑料盆，将不同浓度的Na2SeO3用去离子水配成溶液后加入土中充分拌匀，每盆装土1.5 kg，均施入有机肥50 g作为底肥，每盆播种40粒种子，5天出苗，7天后间苗至10株，14天后每盆定植5株，并置于人工气候箱中培养 (相对湿度60%，温度20℃，光照/黑暗各12 h)，分别于定植后的第14、28、42天每个处理随机取4盆，测定其菠菜叶中可溶性糖、可溶性蛋白、Vc、硝酸盐含量及土壤铵态氮、硝态氮的含量、脲酶活性等指标。

1.3 测定方法

土壤pH采用水土1∶10浸提，pH计测定；粘粒含量用激光粒度仪测定；土壤有机质用重铬酸钾容量法；全氮用凯氏定氮法；NH4+-N含量采用靛酚蓝比色法；NO3--N含量采用紫外分光光度法 (双波长法)；脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法；Vc (鲜样) 含量采用2，6-二氯酚靛酚比色法；还原糖 (鲜样) 含量采用3，5-二硝基水杨酸比色法；可溶性蛋白 (鲜样) 含量采用考马斯亮蓝G-250染色法；硝酸盐 (鲜样) 含量采用紫外吸收法。

1.4 数据分析

数据采用Excel 2016软件对数据进行处理和作图；运用SPSS19.0统计软件中单因素方差分析(ANOVA) 和最小显著差异 (LSD) 分析不同处理间的差异显著性 (α = 0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的Na2SeO3处理对土壤脲酶活性的影响

如图1所示，培养初期 (14天)，低剂量 (≤ 10 mg/kg) 的Na2SeO3处理，可使土壤脲酶活性较对照明显增加 (P＜ 0.05)，30 mg/kg Na2SeO3处理组的土壤脲酶活性没有明显变化，处于对照水平。培养到中期 (28天) 时，除了10 mg/kg Na2SeO3处理组的土壤脲酶活性较对照有明显增加以外，其余各处理均没有明显变化。培养进入到后期，Na2SeO3各处理组的土壤酶活性较对照均没有明显变化 (P＞ 0.05)。可见低浓度Na2SeO3对土壤脲酶活性有一定影响，较高浓度对其没有影响。

2.2 不同浓度的Na2SeO3处理对土壤有效氮含量的影响

2.2.1 不同浓度的Na2SeO3处理对土壤NO3--N含量的影响 图2表明，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养期内均使土壤NO3--N含量明显增加，到后期 (42天) 均有下降趋势，但仍然高于CK处理组，具有显著性差异 (P＜ 0.05)，其中在28天时1 mg/kg Na2SeO3处理组较CK提高了75%，达到最大值；而10 mg/kg Na2SeO3处理组对土壤的NO3--N含量影响，在培养初期 (14天) 略有增加 (P＜ 0.05)，到中后期 (28天、42天) 硝态氮含量下降至对照水平，差异不显著 (P＞ 0.05)。可见不同浓度的Na2SeO3对土壤NO3--N含量影响不同。

图1 不同浓度亚硒酸钠处理土壤脲酶活性Fig. 1 Urease activity in soil treated different concentrations of Na2SeO3

图2 不同浓度Na2SeO3处理土壤硝态氮含量Fig. 2 -N content in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.2.2 Na2SeO3对土壤NH4+-N含量的影响 如图3所示，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养过程中对土壤NH4+-N含量影响表现为降低或接近对照水平，而10 mg/kg Na2SeO3处理组的土壤NH4+-N含量，随着暴露时间的增加表现为逐渐下降趋势，但均明显高于CK处理组 (P＜ 0.05)。可见，适量浓度的Na2SeO3可以使土壤-N含量增加。

2.2.3 Na2SeO3对土壤-N/N-N比的影响 不同Na2SeO3处理不仅影响土壤的-N和-N含量，而且会影响到-N/-N比值，同时也将影响到作物硝酸盐含量的变化。

图3 不同浓度Na2SeO3处理土壤铵态氮含量Fig. 3 -N content in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

由表1可知，1 mg/kg和30 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养期内-N/-N比值呈下降趋势，且均高于CK处理，而且在14天时，-N/-N比值均 ＞ 1，说明在培养初期土壤-N占优势，后期-N的含量逐渐增加，使-N/-N比值逐渐减少；10 mg/kg处理组在整个培养期内-N/-N比值均在对照水平上下波动，说明土壤-N与-N之间转化速度接近对照水平。

2.3 不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜品质的影响

2.3.1 不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜硝酸盐含量的影响 如图4所示，1 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养过程中，可使菠菜中的硝酸盐含量较CK明显增加，差异显著 (P＜ 0.05)。10 mg/kg Na2SeO3处理组菠菜硝酸盐含量，培养初期 (14天) 略有增加(P＜ 0.05)，中后期 (28 天、42 天) 均在对照水平 (P＞0.05)。30 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养过程中，菠菜叶中硝酸盐含量表现为初期 (14天) 和中期(28天) 明显高于对照 (P＜ 0.05)，但是到后期 (42天)下降接近对照水平 (P＞ 0.05)。

表1 不同浓度Na2SeO3对土壤-N/-N比值的影响Table 1 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on -N/-N ratios in soil

表1 不同浓度Na2SeO3对土壤-N/-N比值的影响Table 1 Effect of different concentrations of Na2SeO3 on -N/-N ratios in soil

Na2SeO3(mg/kg)NO3--N/NH4+-N 0 54.86 183.02 0.30 6.68 130.11 0.05 5.38 166.78 0.03 1 184.68 122.80 1.50 29.57 100.38 0.29 17.57 130.38 0.13 10 101.51 250.73 0.40 5.10 221.10 0.02 6.43 204.64 0.03 30 221.46 158.76 1.39 20.12 101.41 0.20 13.12 108.08 0.12 14 d 28 d 42 d NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3--N/NH4+-N NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)NO3--N/NH4+-N NO3--N(mg/kg)NH4+-N(mg/kg)

图4 不同浓度Na2SeO3处理菠菜硝酸盐含量Fig. 4 Nitrate content in spinach leaves in soils treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.2 不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜可溶性蛋白含量的影响 从图5可以看出，Na2SeO3对菠菜可溶性蛋白含量的影响，随着培养时间的延长整体上表现为上升趋势，但不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜可溶性蛋白含量影响略有不同。其中1 mg/kg Na2SeO3处理组在整个培养过程中，对菠菜可溶性蛋白含量影响表现为先降低后恢复到对照水平的趋势；10 mg/kg Na2SeO3处理组对可溶性蛋白含量影响较对照均有明显的增加，差异显著 (P＜ 0.05)；30 mg/kg Na2SeO3处理组可溶性蛋白含量则表现降低—恢复—降低的趋势。

图5 不同浓度Na2SeO3处理菠菜可溶性蛋白含量Fig. 5 Soluble protein content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.3 不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜VC含量的影响 从图6可以看出，不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜VC含量的影响不同。1 mg/kg Na2SeO3处理组菠菜Vc含量在培养初期明显增加 (P＜ 0.05)，中后期均在对照水平 (P＞ 0.05)；10 mg/kg Na2SeO3处理组使菠菜Vc含量增加明显 (P＜ 0.05)；30 mg/kg Na2SeO3处理组菠菜Vc含量较对照均没有变化 (P＞0.05)。

图6 不同浓度Na2SeO3处理菠菜Vc含量Fig. 6 Vc content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

图7 不同浓度Na2SeO3处理菠菜可溶性糖含量Fig. 7 Soluble sugar content in spinach leaves in soil treated with different concentrations of Na2SeO3

2.3.4 不同浓度的Na2SeO3处理对菠菜可溶性糖含量的影响 从图7可知，与对照相比，除了10 mg/kg Na2SeO3处理组在28天内菠菜可溶性糖明显增加和30 mg/kg处理组在培养后期 (42天) 菠菜可溶性糖明显减少以外 (P＜ 0.05)，其余各处理对菠菜可溶性糖含量影响不大 (P＞ 0.05)。

2.3.5 Na2SeO3对土壤有效氮含量及菠菜品质影响路径分析 Na2SeO3是水溶性的，是植物的重要硒源。Na2SeO3进入土壤在根部—作物之间被吸收、转运、转化的路径如图8所示。

当Na2SeO3被施入土壤内，一种路径是其通过影响土壤酶系统，进而影响土壤的氮素代谢，最终反映在土壤NH4+-N和NO3--N含量的变化上[21]；NH4+-N和NO3--N是植物吸收的主要N素形态，进入根细胞内NH4+-N直接参与含N化合物的合成，而NO3--N一部分贮存在液泡，或者进入质体在硝酸还原酶(NR) 作用下，形成NH4+-N，参与含N化合物的合成。根细胞中NO3--N在导管中随蒸腾流到达叶肉细胞内，分布于细胞的液泡和原生质体中，由于NR主要存在于原生质中，其中的NR可以迅速还原，不易积累；而液泡中的NR活性低，硝酸盐主要起渗透调节作用，难以被还原利用，因而易被累积[22]，进而影响到蔬菜的安全品质。同时NO3--N在原生质和叶绿体内均可以转化为NH4+-N，为蛋白质、叶绿素等含氮化合物的合成提供原料，并且间接影响到光合作用的产物可溶性糖和Vc含量变化。

另一条路径是Na2SeO3进入土壤直接被根部吸收，进入作物体内发生形态上转化，直接或间接参与蛋白质的合成。有研究表明，Na2SeO3通过磷酸盐转运子进入根部，进入根部后可转化为硒酸盐和其他硒化物向地上部分运输到叶片，再由无机硒转化为有机硒，一方面有机硒非特异性参与蛋白质合成，影响作物蛋白含量变化。另一方面在某些硒超积累植物中可以转化为挥发性硒化物，从而降低硒与蛋白的结合，达到降低硒毒害的作用用[11]。

图8 亚硒酸钠对土壤有效氮含量及作物品质影响路径Fig. 8 Pathway of the effect of Na2SeO3 on soil available nitrogen content and crop quality

综合分析Na2SeO3在土壤中被根部吸收并转化为作物品质的路径可以看出，不同浓度Na2SeO3不仅对土壤脲酶、有效态氮含量及其NO3--N/NH4+-N比有一定的影响，而且也影响作物从根部、叶面将外源硒吸收转化为可食部分的转化率[9,12,14]，同时作物品质也随着发生不同程度的变化。有试验表明，低浓度(1.095 mg/kg) 亚硒酸钠处理的作物中硒含量明显高于对照组[9]，而本试验显示，相似剂量亚硒酸钠处理条件下，作物各项营养指标品质含量有不同程度变化，如1 mg/kg Na2SeO3处理组可使菠菜叶的硝酸盐含量明显增加，Vc含量先增后减，可溶性蛋白含量减少，可溶性糖含量没有变化。可见硒在植物体内转化率与硒对作物品质影响之间没有明显的相关性。

3 讨论

土壤中一切生化过程都是在酶的参与下进行的，土壤酶活性直接影响着土壤有效养分的释放，其中脲酶是土壤氮素循环中的关键酶之一，也是专一水解尿素的酰胺酶，其活性高低在一定程度上反映了土壤氮素水平状况和植物有效氮源的利用[23]。土壤中氮素的形态可分为有机态氮和无机态氮两大类。土壤中的氮绝大部分以有机态形式存在，大多数是不能直接被作物吸收利用的含氮化合物，它们需经微生物分解转变为无机态氮后才能为作物利用[24]。无机态氮主要以NH4+-N和NO3--N形式存在，它们是植物从土壤中直接吸收利用的主要氮形态[25]，其含量受诸多因素的影响，如土壤温度、水分、理化性质、有机、无机肥的施用等[26]。本研究发现，低剂量(≤ 10 mg/kg) 的Na2SeO3处理下土壤脲酶活性表现为先被激活后减弱至对照水平的变化趋势。土壤硝态氮含量也表现出相同的变化趋势，而铵态氮与硝态氮含量变化趋势正好相反。可能是由于低剂量的亚硒酸钠在土壤微生物的作用下能被微生物分解、利用，有利于微生物的生长，促进土壤中细菌、真菌和放线菌等微生物数量增加，而微生物数量的增加有助于土壤酶的合成与分泌，导致脲酶活性增加[15]，使脲酶水解产物NH4+-N不断转化为NO3--N，NO3--N含量不断增加，铵态氮NH4+-N含量变化不明显。但随着培养时间的延长，大部分的Na2SeO3被微生物分解完成，微生物可利用的有效态减少，致使微生物的数量减少，同时未被同化的的Na2SeO3一是可能被植物根部直接吸收，二是可能被土壤吸附，与有机物和碳酸盐、铁锰氧化物结合，从而降低其有效性，因此导致后期脲酶活性减弱[27]。而较高剂量 (30 mg/kg) Na2SeO3处理对细菌和真菌数量有降低作用，减少了菌体的合成和分泌[15]，导致土壤脲酶活性减弱。蔬菜生长过程中又不断产生根系分泌物进入土壤中，使根际微生物的数量发生变化[28]，致使土壤脲酶活性减弱不明显，产生的NH4+-N在后期由于转化成大量NO3--N供植物吸收利用，使土壤NH4+-N含量较少。

不同浓度Na2SeO3不仅对土壤酶活性、有效态氮含量及其NO3--N/NH4+-N比有一定的影响，而且也影响菠菜的品质。

硝酸盐含量高低是衡量蔬菜安全品质好坏的一个重要指标，而菠菜属于硝酸盐高累积蔬菜之一[29-30]。硝酸盐在植物体内的积累是一个氮素在植物体内吸收转化与积累的过程，基质中铵态氮和硝态氮的比例是决定硝酸盐含量的重要因素[31]。本研究显示，1、30 mg/kg Na2SeO3处理组可使菠菜中的硝酸盐含量较对照有不同程度增加。可能是由于其NO3--N/NH4+-N比值均高于对照，而且土壤中硝态氮占的比例高，如果植物吸收的硝态氮的速率大于同化的速率，硝态氮会在植物体内积累，硝酸盐含量也相应增加[32]。而10 mg/kg Na2SeO3处理组菠菜硝酸盐含量增加很少，或接近对照水平，可能是由于初期 (14 d)的NO3--N/NH4+-N比值略高于对照，而中后期的NO3--N/NH4+-N比值接近或略低于对照，当铵态氮占优势时，植物硝酸盐含量下降。因为铵态氮被植物吸收后，立即参与合成作用，而硝态氮被植物吸收后要先还原成铵态氮后才能参与合成过程，此还原过程需耗能且需有相应的酶系统参与[31]。

可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老和抗性密切相关[33-34]。有研究表明，喷施亚硒酸钠可使苦苣中可溶性蛋白含量表现为降低-升高-降低的变化趋势[35]。本研究在1、30 mg/kg Na2SeO3处理组的可溶性蛋白含量也表现出相似的变化趋势。可能的原因是Na2SeO3供给植物后，在根部被吸收并转化为硒酸盐和其它硒化物向地上部运输至叶片，并由无机硒转化为有机硒，非特异性的参与蛋白质的合成，这一转化速度小于根吸收过程，因此在根内常积累一定量的硒[36]，表现为土壤脲酶活性受到不同程度的影响，土壤有效氮也随之变化，而有效氮被植物吸收进入叶肉细胞以后，NO3--N在原生质和叶绿体内均可以转化为NH4+-N，为蛋白质的合成提供原料。并且通过本试验发现在10 mg/kg处理组对NH4+-N含量的影响大于NO3--N，土壤中NH4+-N占优势，而NH4+-N被植物吸收后，立即参与合成作用，致使可溶性蛋白含量增加[31]。

Vc又称抗坏血酸，是一种普遍存在于植物组织的抗氧化物质[37]，主要利用光和产物葡萄糖-6-磷酸为原料通过L-半乳糖途径在线粒体中合成的[38-39]。Na2SeO3通过影响土壤的有效氮含量变化，间接影响到光合作用产物Vc含量的变化。有研究表明，适量硒肥可以提高番茄、菠菜等作物的Vc含量[32,40]。本研究中10 mg/kg Na2SeO3处理组使菠菜Vc含量增加明显，这也证实了这一结论。可能原因是由于硒能够提高植株中硒蛋白的含量，从而减轻植株细胞内过氧化氢和脂质过氧化物对Vc的氧化作用[19,41]。另外，10 mg/kg Na2SeO3处理组的NH4+-N含量增加明显，可以为蛋白质和叶绿素等含氮化合物的合成提供更多原料，从而间接影响与光合产物相关的Vc含量的变化。

可溶性糖是植物的光合产物[42]，也是碳水化合物代谢和短暂贮藏的主要形式，对高等植物生长发育及生殖有重要影响[43]。有研究表明，用适量的Na2SeO3处理可使苹果、苦苣等果蔬的可溶性糖含量增加[35,44]。本试验中10 mg/kg Na2SeO3处理组28 d内菠菜可溶性糖含量变化也显示同样的结果。可能原因是由于Na2SeO3处理使土壤中的铵态氮含量占优势，植物吸收后为叶绿素提供原料，间接使光合作用产物可溶性糖含量增加。而30 mg/kg处理组在培养后期 (42天) 可溶性糖含量出现下降，可能是在培养后期 (42天) 的土壤中NH4+-N含量减少，植物吸收后为叶绿素提供原料减少，使光合作用产物可溶性糖的含量相应减少，这与王建飞等[32]、张春兰等[45]研究的结果是一致的。

4 结论

1) 低剂量 (≤ 10 mg/kg) 的 Na2SeO3处理下土壤脲酶活性表现为先被激活后减弱至对照水平的趋势。土壤硝态氮含量也表现出相同的变化趋势，而铵态氮含量变化趋势正好相反；较高剂量 (30 mg/kg)Na2SeO3处理对土壤脲酶活性没有明显的影响，在整个培养时期均在对照水平。土壤NH4+-N含量表现为后期明显减少，转化成的NO3--N明显增加，有利于吸收利用。

2) 不同浓度的Na2SeO3不仅对土壤脲酶、NH4+-N和NO3--N含量及NO3--N/NH4+-N比值产生不同影响，而且也影响到菠菜品质。本研究结果显示，1 mg/kg Na2SeO3处理组可使菠菜叶的硝酸盐含量明显增加，Vc含量先增后减，可溶性蛋白含量减少，可溶性糖含量没有变化；10 mg/kg处理组可使菠菜叶中的硝酸盐、可溶性糖含量表现为先增后减，Vc含量、可溶性蛋白含量均有不同程度增加；30 mg/kg处理组可使菠菜叶的硝酸盐含量先增后减，可溶性蛋白、可溶性糖含量减少，Vc含量没有变化。

3) 硒在植物体内转化率与硒对作物品质影响之间没有明显的相关性。富硒作物生产中无机硒肥施用量要综合考虑硒在作物体内的转化率及硒对作物品质影响的各项因素而确定。

致谢：本试验过程中得到本钢板材股份有限公司徐明的帮助，特此感谢！