奶牛乳腺分支模型的建立

崔英俊，于广璞，汤云飞，李慧铭，边艳杰，孙喆，刘智宇，孙霞

（东北农业大学生命科学院，哈尔滨150030）

0 引 言

奶牛乳腺分支形态发育是成功泌乳的基本条件。有效的乳腺分支结构能提高乳腺腺泡的数量和分泌功能，提高奶牛乳产量。乳腺发育过程由体内微环境构建庞大的激素网络调控，其复杂程度对乳腺发育机理的研究造成困难，而乳腺体外模型有利于阶段性的观察。目前对乳腺分支模型的研究多见于小鼠和人，尚无关于奶牛乳腺分支模型的报道[1-3]。

本研究利用从青春期奶牛乳腺中提取的类器官，在I型胶原中以镶嵌式进行三维培养，用FGF2处理来建立奶牛乳腺分支模型，旨在通过奶牛乳腺分支模型的建立，为进一步在体外研究奶牛乳腺分支的分子机理提供理论基础。

1 实 验

1.1 实验动物及取材

处于青春期的健康荷斯坦奶牛，饲养管理条件一致。

1.2 试剂和仪器

Ⅳ型胶原酶，鼠尾Ⅰ型胶原，DMEM/F12，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，FGF2），DnaseⅠ内切酶，胰岛素/转铁蛋白/硒（insulin/transferrin/selenium，ITS）。

1.3 方法

1.3.1 奶牛乳腺类器官的获取

取新鲜健康青春期荷斯坦奶牛乳腺组织，去除脂肪组织和结缔组织后，清洗并剪成1 mm3的组织小块。将组织小块放入100 mL的DMEM/F12溶液（质量浓度为1 g/L的Ⅳ型胶原酶）中，于37℃摇床上消化3 h。将消化液用铜网过滤，滤液分装在用质量分数为2.5%BSA预铺好的10 mL离心管中，在转速为1 500 r/min下离心15 min。将沉淀用DMEM/F12悬浮，加入浓度为2 000 U/mL的DnaseⅠ静置后，转速为1 500 r/min下离心10 min，收集沉淀。然后加入DMEM/F12溶液10 mL，重悬细胞沉淀。之后放入离心机中（1 500 r/min）3～4 s后停止，收集沉淀。此即为奶牛乳腺类器官沉淀。

将沉淀置于10 mL的DMEM/F12中充分混匀，从中转移50μL的混液，置于血细胞计数板上，在光学显微镜下计数。将调整好质量浓度的混液以1 500 r/min室温离心，收集沉淀。

1.3.2 奶牛乳腺类器官镶嵌入Ⅰ型胶原

将鼠尾Ⅰ型胶原的pH值调到中性，然后用DMEM/F12培养液在冰上调节鼠尾Ⅰ型胶原质量浓度（终质量浓度3 g/L）。在铺胶之前将鼠尾Ⅰ型胶原放在4℃冰箱中预冷1 h。

在24孔板上预铺20μLⅠ型胶原，37℃放置待Ⅰ型胶原完全凝固后，将收集好的类器官沉淀与Ⅰ型胶原混匀，加在预铺好的24孔板上，每个孔150μL。放入37℃的培养箱中1 h，待Ⅰ型胶原完全凝固，每孔加入2 mLDMEM/F12基础培养液（含1×ITS），FGF2组另加入FGF2（终质量浓度50 ng/mL）。每隔2天换1次液。

1.3.3 奶牛乳腺三维培养的形态学观察

在初加入培养基时利用相差显微镜拍照，此时定为0 h。分别在第0，12，36，60，84 h进行形态学观察。

1.3.4 奶牛乳腺三维培养的分支率计算

选择放大倍数为100倍的照片，每张照片随机挑选3个不同视野，视野内类器官总数不少于50个，进行类器官计数。

分支率的计算公式为：具有分支形态的类器官/类器官总数×100%。

1.4 数据处理与分析

应用SPSS19.0统计分析软件对奶牛乳腺分支率进行t检验。数据以平均数（M）±标准误（SE）表示。实验重复3次。

2 结 果

2.1 奶牛乳腺类器官的获取

将新鲜健康青春期荷斯坦奶牛乳腺组织剪成小块，加入Ⅳ型胶原酶溶液中（质量浓度为1 g/L的Ⅳ型胶原酶），37℃消化3 h，过滤。将滤液分装在预铺好2.5%BSA的离心管中，1 500 r/min离心15 min，取上层脂肪层再次混匀离心，收集两次沉淀，沉淀在镜下观察如图1a。可见细胞中有絮状物杂质。加入2 000 U/mL的DnaseⅠ混匀静置5 min，静置后，在镜下观察见絮状物消失（图1b）。重悬细胞沉淀，放入离心机中（1 500 r/min）3～4 s，差速离心后收集沉淀可见单细胞基本清除，剩下团状的细胞组织（图1c）。详细流程如图2所示。

图1 奶牛乳腺类器官的提取过程中的镜下观察

2.2 奶牛乳腺三维培养的形态学观察及分支率计算

通过形态学观察发现，对照组在84 h内无分支形态出现（图3A1-A5）；FGF2组在36 h时镜下即可见分支形态（图3B3）。分支率计算的结果表明，从36 h开始，FGF2组分支率显著高于对照组（P＜0.05）（图4）。

A1-A5分别代表对照组乳腺上皮类器官在0，12，36，60，84 h的形态学变化；B1-B5分别代表FGF2乳腺上皮类器官在 0，12，36，60，84h的形态学变化（200×）。

3 结果与讨论

乳腺与肺、肾、唾液腺等上皮器官一样，能通过分支形态发生而形成树状结构[4]。细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）是体内平衡和组织表型的关键调节物，它为乳腺上皮细胞提供细胞因子，提供生物力学支撑，并参与细胞膜表面的信号传导[5]。早期研究认为驱使乳腺上皮侵入脂肪垫并形成分支的过程，与ECM重塑相关的酶有关[3]。

图2 奶牛乳腺类器官的提取流程

图3 奶牛乳腺上皮类器官在三维培养中的形态学变化

图4 奶牛乳腺上类器官在三维培养中的分支率

在对乳腺分支形态发生进行体外研究时，三维培养能比二维培养更好得模拟体内情况，在研究细胞行为和功能方面更有说服力[6]。青春期的乳腺分支结构，可以通过将乳腺上皮细胞镶嵌在Ⅰ型胶原中，并用细胞因子刺激来进行三维培养而重现[4，7]。Ⅰ型胶原是正常乳腺ECM中最丰富的成分[5，8]。之后人们通过在Ⅰ型胶原中镶嵌培养称为类器官的小块雌性小鼠乳腺腺体，在体外也重现了乳腺导管发育。乳腺分支形态形成还取决于细胞因子的相互作用，在I型胶原中培养乳腺上皮细胞时，乳腺分支被肝细胞生长因子、转化生长因子（transforming growth factor，TGF)-α、FGF7和FGF2上调，被TGF-β家族成员抑制，但是这些细胞因子的作用机制还需要进一步研究[9-10]。

本研究将自青春期奶牛乳腺组织中获取的类器官镶嵌在Ⅰ型胶原中进行三维培养，发现在FGF2作用下，与对照组相比，奶牛乳腺类器官自36 h开始就具有了明显的分支形态，且之后分支率一直显著高于对照组，说明已成功建立奶牛乳腺分支模型，这与在人和小鼠中得到的结果相一致[2-3]，证实了乳腺分支模型的建立方法在反刍动物中也同样可行。这个模型也将为奶牛乳腺分支相关机理的研究提供物质条件和理论基础。