范氏法与王玉万法植物纤维素测定方法探讨

李朝英，郑路,2*，莫世宇

(1.中国林业科学研究院热带林业实验中心，广西 凭祥 532600； 2.广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站，广西 凭祥 532600)

纤维素是植物细胞壁的主要成分之一。纤维素含量是评价植物细胞机械组织发达程度及作物抗倒伏、抗病虫害能力的主要依据，还是鉴定粮食、蔬菜及纤维作物产品品质的重要指标。纤维素是自然界最为丰富的可再生资源，在造纸、涂料、聚合物等方面有广泛应用[1-3]。纤维素准确定量分析方法的建立对纤维素的开发利用有着重要作用。当前，纤维素含量测定方法主要有NREL法、王玉万法、范氏法。NREL法所用的高效液相色谱仪可对不同极性或不同比例溶液中的多种成分进行准确检测分析，但仪器昂贵，尚未普及。王玉万法和范氏法以蒽酮比色法或重量法检测纤维素含量，检测设备简单，适用于大多数实验室[4-5]。其中，蒽酮法的测定原理是，纤维素为β-葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热分解的β-葡萄糖与蒽酮脱水缩合，生成黄色的糠醛衍生物，由其颜色深浅可定量测定纤维素含量高低。重量法的测定原理是，将样品经酸性洗涤剂消煮所得酸性洗涤纤维(ADF)加硫酸水解纤维素，抽滤清洗后残渣与ADF的差值即为纤维素含量[6-7]。

现期研究多以范氏法检测饲料等植物纤维素、膳食纤维素含量，但有关范氏法测定纤维素含量的影响因素的讨论分析尚未见报道。同时，重量法和蒽酮比色法测定纤维素含量的比较分析也未见报道。王玉万法与范氏法在测定纤维素时，样品消煮用的洗涤剂、消煮时间及消煮方式均不同，两种方法的样品处理程序对纤维素测定结果的影响尚不明确。鉴于此，本试验对范氏法中样品消煮时间及硫酸浓度、加硫酸静置时间进行讨论分析，探讨影响范氏法测定纤维素含量的因素，同时对比分析范氏法-重量法和范氏法-蒽酮法、王玉万法-重量法和王玉万法-蒽酮法测定植物纤维素的含量，以期为实验室准确测定植物纤维素含量，科学选择适宜的测定方法提供可行的参考指导。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

硫酸，丙酮，十六烷三甲基溴化铵，酸性洗涤剂(20 g十六烷三甲基溴化铵溶于1 000 mL的0.5 mol·L-1硫酸中)，十氢化萘，丙酮，蒽酮，葡萄糖，中性洗涤剂(18.6 g乙二胺四乙酸二钠和6.8 g硼酸溶于少量水中，加入含有30 g十二烷基硫酸钠和10 mL乙二醇乙醚、4.56 g无水磷酸氢二钠的溶液，定容至1 000 mL)。以上试剂均为分析纯级别。

电子分析天平(精确至十万分之一克)，石墨加热板，真空泵，马弗炉，烘箱，Fibertec8000纤维素分析仪。

1.2 样品采集与处理

2017年4月于广西友谊关森林生态系统国家定位观测研究站在热带林业实验中心伏波实验场采集马尾松(Pinusmassoniana)人工林内的马尾松侧枝(以下简称马枝)、2年生桉树(Eucalyptusrobusta)人工林内的桉树侧枝(以下简称桉枝)、佛肚竹(Bambusaventricosa)侧枝(以下简称竹枝)，以及林缘生长的鬼针草(Bidenspilosa)全株(以下简称草株)。植物样品在干燥箱中65 ℃烘干后粉碎，过18目筛(粒径≤1 mm)，装袋保存备用。

1.3 测定方法

1.3.1 范氏法-重量法

称取样品0.250 0 g，加入25 mL酸性洗涤剂，加5滴十氢化萘，瓶口加漏斗，保持小沸一定时间，趁热倒入已知质量的G2玻璃坩埚抽滤，并用热水冲洗残渣至滤液无泡沫且呈中性。用丙酮冲洗残渣至滤液呈无色，抽净丙酮并烘干称重。倒入3 mL的72%硫酸，如硫酸渗滤下去则及时补加，室温放置3 h后用热水冲洗到中性，收集滤液，并定容到200 mL。残渣于105 ℃烘箱中烘干称重，计算含量。

按上述方法进行操作，将消煮时间分别设置为1.0、1.5、2.0 h，或将硫酸浓度分别设置为68%、70%、72%、75%，进行对比试验。

1.3.2 王玉万法-重量法

称取样品0.500 0 g，加入50 mL中性洗涤剂，在100 ℃高压锅中保温1 h，以2号砂芯漏斗过滤至滤液呈中性，残渣用丙酮洗两次。残渣转移到50 mL比色管中，加入50 mL的2 mol·L-1盐酸溶液，100 ℃高压锅保温50 min，以G2砂芯坩埚过滤至滤渣呈中性，用丙酮洗2次，加入72%硫酸5 mL，常温水解3 h，加水45 mL，室温过夜。之后烘干、称重、灰化操作同1.3.1节。

1.3.3 范氏法-蒽酮法

将1.3.1节收集的滤液抽取1 mL，稀释至10 mL。抽取1 mL，加入4 mL蒽酮试剂，沸水浴10 min，冷却后于620 nm处测定。抽取0.1 mg·mL-1葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分别加入1、0.8、0.6、0.4、0.2 mL水，补足1 mL，加4 mL蒽酮试剂，沸水浴10 min，冷却后于620 nm处测定，所测结果乘以0.9。

1.3.4 王玉万法-蒽酮法

将1.3.2节收集的滤液抽取1 mL，同1.3.3节重复操作。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行整理及绘图，使用SPSS 17.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 消煮时间对范氏法-重量法测定的影响

由图1可见，消煮1 h所测ADF及纤维素含量偏高，消煮1.5 h所测ADF及纤维素含量有所下降，与消煮2 h的趋于一致。这是因为：样品消煮1 h时，其中的多糖物质未被酸性洗涤剂充分溶解，导致所测ADF中包含了残留的多糖物质，加硫酸后，残留多糖及纤维素水解，故所测纤维素偏高；样品消煮1.5～2 h，植物组织中的多糖物质溶解充分，加硫酸后，纤维素水解充分，所测纤维素含量不受多糖干扰，故所测结果更加准确。

图1 不同消煮时间对测定结果的影响

消煮1 h所测ADF及纤维素的标准差均>2%，而消煮1.5～2 h所测ADF及纤维素的相对标准差均<2%，这说明消煮1.5～2 h后，测定的ADF及纤维素含量离散度较小，误差较小。可见，样品消煮1.5～2 h有利于纤维素含量的准确测定。

2.2 硫酸浓度对范氏法-重量法测定的影响

由图2可见，加68%、70%硫酸时所测纤维素偏低，加72%、75%硫酸时所测纤维素含量结果较一致。这可能是因为68%、70%的硫酸未能充分水解纤维素，72%、75%的硫酸水解纤维素更充分。同时，加68%、70%硫酸所测纤维素的标准差>2%，而加72%、75%硫酸所测纤维素的标准差<2%。说明用72%、75%硫酸所测的纤维素含量离散度小，检测精密度更优。

图2 不同浓度硫酸对测定结果的影响

2.3 不同方法测定结果的比较

由表1可见，范氏法-重量法与王玉万法-重量法所测结果的相对标准偏差均<4%，而范氏法-蒽酮法与王玉万法-蒽酮法的标准偏差均>4%。可见，范氏法-重量法与王玉万法-重量法所测结果的精密度优于范氏法-蒽酮法与王玉万法-蒽酮法。整体来看，重量法所测结果大于蒽酮法的，尤其是在草株上，重量法的测定结果显著高于蒽酮法。重量法操作简单，检测误差易于控制。蒽酮法的待测液来自重量法的检测系统，但后续操作烦琐，检测干扰多且不易控制，检测误差高于重量法。

表1 不同方法的测定结果对比 %

注：同行数据后无相同字母的表示差异显著(P<0.05)。

对范氏法与王玉万法以重量法所测的纤维素含量作拟合(图3)，2种方法所测结果趋势一致，相关性良好。这说明王玉万法与范氏法以不同洗涤剂及程序处理样品，但两者均能充分溶解植物组织中的多糖，避免残留在ADF中，不致对纤维素含量测定造成干扰。

图3 范氏法与王玉万法所测纤维素含量的相关性

3 小结与讨论

本研究表明，范氏法-重量法测定纤维素时，样品适宜的消煮时间为1.5～2 h，适宜的硫酸浓度为72%～75%。范氏法与王玉万法以重量法所测纤维素含量结果趋于一致，精密度良好。重量法操作简单，易于控制，精密度高于蒽酮法，是测定植物纤维素的优选方法。

GB/T 20805—2006和GB/T 2677.8—1994多以稻壳、花生壳类农副产品为样品，消煮1 h后，以72%硫酸水解纤维素。本试验发现，适宜消煮时间长于1 h。这是因为本试验以乔木为样品，组织细胞致密，洗涤剂浸润扩散用时长；而以往研究多以稻壳、花生壳类农副产品为样品，这类样品的组织细胞疏松，洗涤剂易于浸润。本试验提出的消煮时间适用的样品范围更广泛。本试验提出的硫酸浓度范围较以往研究宽泛，更有利于操作。蒽酮法中，显色剂配制时间长短及加入快慢等都会影响检测，且显色剂专一性差，纤维素水解过程中木糖也随之水解，会干扰检测。因此，蒽酮法的检测误差难以避免，且重复性较重量法欠佳[8-10]。