莪术挥发油对人宫颈癌裸鼠移植瘤血管生成VEGF通路的研究

周俊

【摘 要】

目的：探讨莪术挥发油对人宫颈癌裸鼠移植瘤血管生成VEGF通路的可能作用机制。方法： 对处死裸鼠剥取肿瘤标本检测瘤重、瘤体积，计算抑瘤率；采用免疫组织化学技术检测VEGFR-2、VEGF-C的蛋白表达。结果：莪术油高、中剂量组VEGF-C的表达较模型组显著降低； 莪术油高、中、低剂量组VEGFR-2的表达较模型组降低。 结论：莪术油对人宫颈癌hela细胞裸鼠移植瘤的血管生成有明显的抑制作用。

【关键词】莪术油；hela细胞；血管生成；裸鼠；VEGF

【中图分类号】 R197.3

【文献标识码】 A

【文章编号】 1672-3783（2019）02-03-063-01

肿瘤是一种超过正常限度生长的组织，而其新生血管的形成对肿瘤的生长和转移具有重要意义。血管生成是指活体组织在已经存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。有别于胚胎时期由早期內皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成（vasculogenesis）[1]。肿瘤血管生长可分为前血管期（avascular phase）和血管期（vascular phase）。在前血管期，肿瘤细胞主要依靠弥散供养以及排泄废物。这个时期肿瘤细胞增殖迅速，但是增殖与凋亡处于动态平衡，肿瘤直径不超过1～2mm，可保持数月或数年不发生转移。当肿瘤组织直径大于1cm后，被激活的肿瘤组织通过“自分泌”或“旁分泌”机制合成和分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor， VEGF），促进肿瘤周围组织建立起丰富的毛细血管网，有利于肿瘤细胞在新的部位生长及增殖[2]，这就是血管期。本研究通过人宫颈癌裸鼠移植瘤模型治疗实验，评价莪术油有效提取物治疗人宫颈癌的有效性，初步探讨莪术油有效提取物的动物体内抗宫颈癌的作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞株、动物及药物：人宫颈癌Hela细胞株，购自武汉大学保藏中心。Balb/c-nu品系裸鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于贵阳医学院动物中心SPF级动物实验室独立笼盒饲养系统。温莪术药材购于四川双流县温郁金基地，经鉴定为姜科植物温郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）的干燥根茎。采取压榨粗油经水蒸汽精制法制备莪术挥发油。阳性药物5-Fu（5-氟尿嘧啶），购于天津金耀氨基酸有限公司。VEGF-C兔抗人多克隆抗体、VEGFR-2兔抗人多克隆抗体、PV9000二步法试剂盒，购于北京中杉金桥。

1.2 实验方法

1.2.1 人宫颈癌裸鼠移植瘤模型的建立

于裸鼠右侧腋部外上方皮肤注射hela细胞悬液，7d后接种Hela细胞的裸鼠均出现直径大约5mm的皮下结节，移植瘤模型建立。接种后将已建立皮下移植瘤模型的裸鼠随机分为莪术油低剂量组（8mg/kg）、莪术油中剂量组（16mg/kg）、莪术油高剂量组（32mg/kg）、模型组、5-Fu组（20mg/kg），加上正常对照组，共计6个实验组。腹腔注射给药给药，共给药10次，持续20天。

1.2.2 观察指标

1.2.2.1 移植瘤重量及体积

抑瘤率（%）=（1-治疗组平均瘤重/模型组平均瘤重）×100%。根据V=ab2/2（单位mm3）公式计算肿瘤体积，绘制瘤体生长曲线。

1.2.2.2 免疫组化法的检测

取肿瘤组织标本，采用PV二步法免疫组化技术，按照北京中杉金桥试剂盒说明书进行操作。VEGF-C、VEGFR-2的阳性表达均定位于宫颈癌细胞的胞浆，并呈棕黄色颗粒，根据平均透光度进行测评。

1.3 数据统计

采用SPSS17.0软件系统对相关数据资料进行分析，计量资料用x±s表示，各组间两两比较采用独立样本T检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05时认为有统计学意义。

2 结果

2.1 瘤重、瘤体积检测

莪术油高、中、低剂量组瘤重与模型组比较明显减轻，差异具有统计学意义；高、中剂量组瘤体积与模型组比较显著缩小，差异具有统计学意义。

2.2 免疫组化染色结果

2.2.1 VEGF-C的表达结果

各组裸鼠肿瘤组织VEGF-C的表达，显微镜下可见，肿瘤细胞胞浆中呈棕黄色改变即为阳性改变。平均透光度测量值与免疫组化标记表达程度呈反比关系，莪术油高、中、低剂量组VEGF-C平均透光度的结果与模型组比较显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2.2 VEGFR-2的表达结果

各组裸鼠肿瘤组织VEGFR-2的表达，显微镜下可见，肿瘤细胞胞浆中呈棕黄色改变即为阳性改变。平均透光度测量值与免疫组化标记表达程度呈反比关系，莪术油高、中剂量组VEGFR-2平均透光度的结果与模型组比较显著降低，莪术油低剂量组VEGFR-2平均透光度的结果与模型组比较明显降低，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。

3 讨论

血管生成（angiogenesis）是近年来兴起的一个新的医学研究领域，肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成，这一观点被认为是肿瘤研究领域中一个新的里程碑。目前发现的VEGF受体有5种：血管内皮生长因子受体-1（VEGFR1，Flt-1）、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR2，KDR）、血管内皮生长因子受体-3（VEGFR3）、神经纤毛蛋白-1受体（NP-l）、神经纤毛蛋白2受体（NP-2）[3-4]。研究证实， VEGFR-2在VEGF的信号转导及血管内皮生成中起主导作用。 因此， VEGFR-2成为当前抗肿瘤血管生成研究中的热点。宫颈癌复发患者的VEGFR-2表达水平明显高于原发者，另外还有人提出，VEGF/VEGFR-2途径通过新生血管的形成增加肿瘤的转移的结论[5]。有研究发现，宫颈癌组织中有VEGF-C 及其受体VEGFR-2（KDR） 的表达，但VEGFR-3 主要在间质淋巴管表达。因此提出，VEGF-C作用于肿瘤细胞上的VEGFR-2（KDR） ，可能直接影响肿瘤细胞的生物学行为[6]。

研究结果显示在体外荷瘤裸鼠移植瘤中莪术油高、中、低剂量组VEGF-C平均透光度的结果与模型组比较显著降低，差异有统计学意义。VEGFR-2平均透光度的结果与模型组比较均有降低，差异具有统计学意义。两者研究结果在抗肿瘤血管生成方面呈正相关性。表明莪术油可能通过下调VEGF这条信号通路，达到抗肿瘤血管生成的目的。莪术油能抑制人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的生长，其可能作用机制与下调血管内皮生长因子VEGF-C和VEGFR-2蛋白的表达有关， 血管生成是肿瘤生长转移过程中的关键步骤，血管生成因子又在其中起了重要作用。抗血管生成治疗作为抗肿瘤治疗的新方法具有广阔应用前景。

参考文献

[1] 陈锡强，侯海荣，刘可春等.天然产物抗血管生成的研究进展[J].山东科学，2010，23（6）：34-38.

[2] 万 博， 刘 煜.作用于VEGF信号通路的血管生成抑制剂[J].综述与专论，2010，34（6）：256-263.

[3] 赵淑萍，王泽华.宫颈癌中VEGF—C及其受体mRNA的表达及其临床意义[J].中国癌症杂志，2006，16（4）：290-294.

[4] 杜雪，糜若然.VEGF-C 对宫颈癌细胞增殖和凋亡信号传导通路的影响[J].现代妇产科进展，2011，20（11）：877-855.

[5] 陈星，王美芬，吴朝阳等.siRNA 沉默VEGF-C基因对宫颈癌HeLa 细胞的生物学特性影响[J].医学研究杂志，2011，40（11）：58-63.

[6] 高经纬，黄剑飞.VEGFR-2（KDR）抗体与妇科恶性肿瘤[J].南通大学学报，2013，33（2）：123-125.