干细胞相关基因Nestin在胃神经内分泌肿瘤中的表达及临床意义

叶郁红， 叶建刚， 陈余朋， 王 密， 王鹏程， 张 声

Nestin是第Ⅵ类中间丝蛋白，与细胞的自我更新能力相关，目前被认为是肿瘤干细胞标记[1]。已有研究表明，Nestin在多种恶性肿瘤组织中表达，如胶质母细胞瘤、乳腺癌、前列腺癌[2-4]，但Nestin在胃神经内分泌肿瘤(gastric neuroendocrine neoplasm, GNEN)中的表达情况尚不清楚，研究Nestin的表达将有助于加深对GNEN肿瘤干细胞的认识。本研究通过免疫组织化学法检测Nestin在GNEN组织中的表达水平，分析Nestin表达与临床病理特点及患者生存时间的关系，以期为GNEN的诊断、治疗及预后提供帮助。

1 对象与方法

1.1对象 回顾性分析福建医科大学附属第一医院病理科2004年7月-2014年12月91例GNEN患者的临床病理资料，所有GNEN患者术前均未接受化疗或放疗，术后病理诊断明确，病历资料完整。男性72例，女性19例；年龄中位数60岁(20～81岁)；贲门42例，胃底-体30例，胃窦19例。按照2010年WHO新标准进行分类[5]，神经内分泌瘤(neuroendocrine tumor，NET)1级20例，NET 2级4例，神经内分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)67 例(小细胞癌32例，大细胞癌13例，混合型神经内分泌癌[2]22例)。根据2010年WHO胃肠胰GNEN TNM临床分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期5例，Ⅲ期37例，Ⅳ期21例。同时选择远离肿瘤(距离>2 cm)的正常胃黏膜组织进行对照研究。随访数据完整的80例，其中死亡30例，生存时间平均18.6月；存活50例，存活者自诊断日期到随访日期11～98月，平均43.3月。

1.2方法 制备好组织芯片，采用EliVision Plus检测试剂盒进行免疫组织化学染色；一抗Nestin(克隆号10C2)及Ki-67(克隆号MIB1)均购自北京中杉金桥公司。Nestin采用pH 9.0 EDTA修复，1∶200室温孵育1 h；Ki-67采用pH 6.0柠檬酸修复，1∶400室温孵育1 h。每批实验均同时设立阴性对照和空白对照。

1.3结果判读标准 Nestin表现为细胞质染色。血管内皮细胞的染色可作为阳性内对照。根据着色强度和着色细胞百分率判断结果。染色强度：无着色为0分，染色比血管内皮细胞弱为1分，染色强度与血管内皮细胞相当为2分，染色比血管内皮细胞强为3分；着色细胞所占比例：无着色为0分，<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分；两项相乘，1～3分为阴性，4～9分为阳性。Ki-67：细胞核表达黄色颗粒者为阳性细胞，阳性细胞数>20%定为阳性，21%～50%定为低表达，>50%定为高表达。

1.4统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件处理数据，不同临床病理参数Nestin阳性率的比较均采用非参数检验；不同生存曲线的显著性用Log-rank法进行分析，P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1Nestin在GNEN组织中的表达 91例GNEN中，27例(29.67%)胃神经内分泌癌(gastric neuroendocrine carcinoma,GNEC)表达Nestin，而24例胃神经内分泌瘤(gastric neuroendocrine tumor,GNET)及周围正常胃黏膜组织均不表达Nestin(图1)。25例GNEC Ki-67高表达，42例GNEC Ki-67低表达。Nestin与Ki-67在GNEC中的表达无明显相关性(P>0.05)。

A：胃神经内分泌癌；B：胃神经内分泌瘤；C：正常胃黏膜组织.图1 Nestin在胃神经内分泌肿瘤及正常胃黏膜组织中的表达 (EliVision ×200)Fig 1 Immunohistochemical expression of Nestin in gastric neuroendocrine neoplasm and normal gastric mucosa(EliVision ×200)

2.2GNEC组织中Nestin表达与临床病理特征的关系 GNEC不同的浸润深度中，浸润肌层及以上的Nestin阳性表达率明显高于浸润黏膜/黏膜下层者，差别有统计学意义(P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ期GNEC的Nestin阳性表达率明显低于Ⅲ～Ⅳ期，两者比较，差别有统计学意义(P<0.05)；脉管侵犯的Nestin阳性表达率明显高于无脉管侵犯者，差别有统计学意义(P<0.05)；GNEC男性患者Nestin 阳性表达率明显高于女性患者(P<0.05)。其他临床病理参数与Nestin表达无相关性(表1)。

2.3Nestin表达与GNEC患者生存率的关系 62例GNEC患者有详细的随访资料，平均随访时间为31月。以Nestin表达与否将GNEC患者分为2组，绘制Kaplan-Meier曲线，比较2组患者生存率的差别。Log-rank检验显示，Nestin阳性表达组患者生存率低，阴性表达组生存率高，差别有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 胃神经内分泌癌Nestin的表达与生存曲线Fig 2 Kaplan-Meier survival curves based on Nestin expression in GNEC

表1Nestin表达与胃神经内分泌癌患者临床病理特征的关系

Tab1Relationship between the expressions of Nestin and the clinicopathological data in GNEC

临床病理特征nNestin-+性别△ 男522725 女15132年龄/岁 ≥61301911 <61372116部位 贲门402218 胃底-体17125 胃窦1064形态学分型 小细胞癌291910 非小细胞癌382117l肿瘤/cm ≥5352213 <5321814浸润深度△ 浸润黏膜/黏膜下层761 浸润肌层及以上602733脉管侵犯△ 无25196 有422121TNM分期△ Ⅰ+Ⅱ981 Ⅲ+Ⅳ583028淋巴结转移 无1376 有543321肝转移 无463016 有211011Ki-67 高表达(>50%)251510 低表达(21%～50%)422517

Nestin表达与性别、浸润深度、脉管侵犯及TNM分期比较，△：P<0.05.

3 讨 论

GNEN是一个谱系的异质性肿瘤，包括NET(G1级和G2级)、NEC(G3级)和混合性腺神经内分泌癌(mixed adenoneuroendocfine carcinoma，MANEC)(G3级)[5]。笔者分析的GNEN大部分为NEC(占73.63%)，贲门为好发部位(占46.15%)；梁晶等分析了75例GNEN，也以NEC居多(占53.3%)，贲门好发(占54.7%)[6]，与笔者研究结果一致。此外，笔者通过在中国人群中分析不同级别GNEN中Nestin蛋白的表达情况，发现部分GNEC标本表达Nestin，而GNET完全不表达Nestin，表明Nestin表达与GNEN组织学分级相关，Nestin的表达差别可能成为GNET与GNEC分型的辅助手段，也进一步证实了NET与NEC有着不同的发病机制[7]。

GNEC治疗方式主要为手术及化疗，其化疗的有效率仅为31%[8]，因此如何避免化疗耐药成为改善患者预后的关键。目前的研究认为，肿瘤干细胞与放化疗耐受能力密切相关[9]，而胃肠道神经内分泌肿瘤组织中已分离出具有强致瘤性的干细胞[10]，因此，如果能找到可靠的GNEC干细胞标志物，就能有效识别并靶向抑制肿瘤干细胞，从而提高治疗有效率。巢蛋白Nestin是一种连接蛋白，参与细胞骨架的构成，最初发现在星形细胞瘤、胶质母细胞瘤等神经系统肿瘤中表达[2，11]，随后发现也表达于一些实体癌，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[3，12-13]，并发现其表达与不良临床病理特征相关。研究证实，Nestin为肿瘤干细胞标记物，它主要通过调节肌动蛋白和细胞黏附分子，从而影响肿瘤细胞的迁移、浸润和转移[14]。此外， Nestin在肿瘤细胞的增殖、凋亡中也起重要作用。Chen等的研究证实，沉默Nestin可能通过下调AKT-GSK3β-cyclin D通路而抑制非小细胞肺癌细胞增生[15]。

本研究显示，Nestin在29.67%的GNEC中表达，而在正常胃黏膜组织中完全不表达，提示Nestin参与了GNEC的发病机制。其次，Nestin在多种肿瘤的研究中显示其表达与不良临床病理特征和不良预后相关。例如Nestin表达与胰腺癌的神经侵犯及腹膜后组织侵犯正相关[13]；在膀胱尿路上皮癌中，Nestin表达与临床分期相关，分期越晚Nestin表达越强，而且Nestin是提示预后差的独立因子[16]。本研究中，Nestin阳性表达率随TNM分期的进展而升高，Ⅲ～Ⅳ期与Ⅰ～Ⅱ期比较，差别有统计学意义(P<0.05)；浸润肌层及以上组和浸润黏膜/黏膜下层组阳性表达率分别为55%及14.29%，二者比较，差别有统计学意义(P<0.05)；脉管侵犯的Nestin阳性表达率明显高于无脉管侵犯者，差别有统计学意义(P<0.05)。在预后方面，Nestin阳性表达组患者的生存率显著低于阴性表达组，这些研究结果与Nestin在其他肿瘤的研究结果一致，提示Nestin可作为辅助判断GNEC临床病理特征及预后的一种指标；Nestin表达越高，预示肿瘤组织中肿瘤干细胞的数量越多，肿瘤的侵袭性及耐药能力就越高，从而预测肿瘤的生物学行为及患者的生存率，为GNEC的诊断、治疗和预后判断提供帮助。

通过临床病理的相关研究发现，Nestin参与了GNEC的发生发展，而与GNET的发病机制无关；Nestin表达提示GNEC浸润深、脉管侵犯几率高、肿瘤分期晚以及患者的预后更差。而关于Nestin在GNEC肿瘤干细胞中的作用机制，目前还不清楚，有待于进一步的分子生物学研究。