雷公藤内酯醇对小鼠H22腹水瘤细胞凋亡及PD-L1表达的影响

邹玉莲， 黄秀旺， 甘陈灵

近年来，癌症已被列为影响中国居民健康的第一病因。传统的临床一线抗癌药物如5-氟尿嘧啶、紫杉醇、长春新碱等，已表现出越来越高的药物耐受率[1-3]，且大剂量使用化疗药物往往加重机体免疫功能的破坏，肿瘤细胞更易发生免疫逃逸。负性调控因子程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-Ligand 1, PD-L1)是最重要的免疫抑制分子，其过表达是介导肿瘤免疫逃逸的关键机制[4]。5-氟尿嘧啶等化疗药物可以诱导人肿瘤细胞PD-L1的表达，诱导T细胞凋亡进而介导肿瘤免疫逃逸，这无疑为经典的化学药物治疗又蒙上一层阴影[5-6]。雷公藤内酯醇(triptolide，TPL)又名雷公藤甲素，是从雷公藤中分离出的环氧二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，具有抗炎、抑制生育、调节免疫反应等药理作用。自Kuchan等首次发现TPL的抗肿瘤活性以来[7]，人们对TPL治疗肿瘤的功效做了大量的研究。体内外实验显示其具有较强及广谱的抗肿瘤作用，对鳞状细胞癌、结肠癌、胆囊癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾癌、肺癌等多种癌细胞都有较好的疗效[8-9]。研究提示，TPL可以诱导肿瘤细胞凋亡，且小剂量TPL即可抑制多种肿瘤细胞的生长[10-11]。体外实验表明，TPL可以下调γ-干扰素诱导的PD-L1表达[12-13]。本研究以H22小鼠腹水瘤为研究对象，探讨TPL抗肝癌的作用机制，为TPL在临床上用于防治肝肿瘤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物、主要试剂与仪器 雷公藤内酯醇购自南京泽朗生物科技有限公司，纯度为99%，分子量为360.4；于实验前以丙二醇(1 mg/mL)新鲜配制。RPMI 1640培养基(美国Corning公司)；1640培养基(美国GEMINI公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(瑞士 Roche公司)；PD-L1(美国eBioscience公司)。CO2生物培养箱(Forma371)、酶标仪(Varioskan Flash)及高速冷冻离心机(Heraeus Multifuge X1R)(美国Thermo公司)；流式细胞仪(FACS Verse，美国BD公司)。

1.1.2动物与细胞 C57BL/6小鼠，雌性，体质量18～22 g[上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2012-0002]，饲养在清洁级环境中。饲养1周后进行实验，每日12 h 光照维持，昼夜循环。小鼠肝癌H22细胞株购买于中科院上海细胞所。

1.2方法

1.2.1小鼠H22 腹水瘤模型的建立 取对数生长期的H22细胞，用RPMI 1640培养液制成每毫升含1.5×107细胞的悬液，取0.2 mL腹腔注射于2只C57BL/6小鼠。接种后第10天，抽取小鼠的腹水，用PBS制成每毫升含1.5×107细胞的悬液，取0.2 mL分别腹腔注射于80只小鼠，作为实验第1天。

1.2.2分组及给药方法 将80只H22腹水瘤小鼠随机分为对照组及TPL低、中、高剂量组，每组20只(15只用于生存期观察，另外5只用于检测其他指标)：实验第3天起，TPL低、中、高剂量组分别隔日尾静脉注射TPL 0.05，0.1，0.2 mg/kg，对照组隔日尾静脉注射等量2%丙二醇溶液。

1.2.3小鼠体质量及生存期 隔日记录各组小鼠的体质量变化情况和生存时间，并绘制体质量曲线和生存期曲线。

1.2.4小鼠腹水体积和腹水中肿瘤细胞数 第14天，各组随机处死5只小鼠，抽取腹水，计量体积，用PBS将腹水稀释10倍，检测细胞密度，计算腹水中的肿瘤细胞数。

1.2.5检测细胞凋亡 取1.2.4中的腹水，离心收集细胞，PBS洗涤2次，按照罗氏公司AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒说明书处理，流式细胞术检测。细胞凋亡率计算方法：

细胞凋亡率(%)=(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/全部细胞数×100%

Annexin V阳性/PI阴性表示早期凋亡，Annexin V阳性/PI阳性表示晚期凋亡。

1.2.6流式细胞仪检测细胞PD-L1的表达 腹水标本处理同上，收集细胞至流式管中，2 000 r/min离心3 min，弃上清，向各流式管中加入2 mL流式液(含1%血清的PBS溶液)重悬细胞，2 000 r/min离心3 min，弃上清，轻轻将管底细胞悬起，各管加入抗体，4 ℃孵育20 min后，加入2 mL流式液，2 000 r/min离心3 min，弃上清，各管加入300 μL流式液，上机检测。

2 结 果

2.1小鼠体质量和生存期变化情况 接种H22腹水瘤后前6天，对照组小鼠的腹水和体质量增加迅速，小鼠进食状况及精神状态较好；第7天后小鼠进食减少，精神欠佳，活动减少；第11天后小鼠腹部膨胀；第13天对照组小鼠逐步开始死亡，到第19天小鼠全部死亡。与对照组比较，TPL各组小鼠的进食及精神状态良好，腹水和体质量增长缓慢，尤以中、高剂量组最明显。给药组小鼠第16天开始死亡，直至第22天全部死亡(图1)。

对照组和TPL低、中、高剂量组小鼠的中位生存期分别为14，17，20和20 d。与对照组比较，TPL各剂量组的生存期均有明显延长(P<0.05，P<0.01，表1)。其中，中、高剂量组较低剂量组延长(P<0.05)，但是中、高剂量组间比较，差别无统计学意义(P>0.05)。

TPL：雷公藤内醇酯. A：TPL对腹水瘤小鼠体质量的影响；B：TPL对腹水瘤小鼠生存期的影响.图1 TPL对腹水瘤小鼠体质量和生存期的影响Fig 1 Effects of TPL on the weight and survival of ascites tumor mice

分 组ρTPL/(mg·kg-1)mOS/d95% CI对照组01414.08～15.78TPL低剂量组0.0517☆16.95～18.26TPL中剂量组0.120☆☆18.32～20.21TPL高剂量组0.220☆☆18.75～20.31

n=15. TPL：雷公藤内酯醇； mOS：中位生存期；CI：置信区间. 与对照组比较，☆：P<0.05； ☆☆：P<0.01.

2.2TPL对小鼠腹水和腹水中肿瘤细胞数的影响 TPL各剂量组的腹水体积和每毫升腹水肿瘤细胞数较对照组减少(P<0.05，P<0.01，表2)，作用具有浓度依赖性。

表2TPL对腹水以及腹水肿瘤细胞数的影响。

Tab2Effects of TPL on the growth of ascites and the number of tumor cells in ascites

分 组ρTPL/(mg·kg-1)V腹水/mL腹水肿瘤细胞数(×108 mL-1)对照组013.9±1.6215.0±1.56TPL低剂量组0.0510.2±1.03☆10.5±1.46☆☆TPL中剂量组0.17.2±0.91☆☆8.3±1.23☆☆TPL高剂量组0.25.9±1.02☆☆7.1±1.22☆☆

n=5. TPL：雷公藤内酯醇. 与对照组比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

2.3TPL对小鼠腹水中肿瘤细胞凋亡的影响 TPL各剂量组的腹水肿瘤细胞凋亡率均较对照组明显增加，对照组、低、中、高剂量组的细胞总凋亡率分别为(11.08±4.12)%，(22.04±3.50)%，(32.38±4.47)%及(43.22±6.36)%，单因素方差分析表明，药物浓度对细胞凋亡影响显著，各组之间两两比较，差别具有统计学意义(图2)。

2.4流式细胞术测定TPL对PD-L1的表达的影响 TPL低、中、高剂量组的H22细胞PD-L1蛋白表达水平明显低于对照组(图3)，单因素方差分析表明，药物浓度对PD-L1表达影响显著(P<0.01)，且TPL低、中、高剂量组 PD-L1蛋白表达两两比较差别亦有显著性。随着TPL药物剂量增加，PD-L1表达水平降低，提示TPL可下调肝癌H22细胞PD-L1的表达，且其下调蛋白表达作用具有浓度依赖性。

TPL：雷公藤内醇酯. A：流式细胞技术分析；B：统计学分析. 不同浓度间比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.图2 TPL对腹水瘤细胞凋亡的影响Fig 2 Effects of TPL on tumor cell apoptosis in mouse ascites

TPL：雷公藤内酯醇. A：流式细胞技术分析；B：统计学分析. 不同浓度间比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.图3 TPL对腹水瘤细胞PD-L1蛋白表达的影响Fig 3 Effects of TPL on the expression of PD-L1 on tumor cell in mouse ascites

3 讨 论

TPL是中药雷公藤的主要有效成分之一，具有高效广谱抗肿瘤的作用。目前，TPL的抗肿瘤作用机制尚不明确，早期的研究认为TPL通过抑制细胞核苷酸转运体系而抑制DNA、RNA的合成，尤其是对DNA合成的抑制。近年来研究显示，TPL可以通过多种途径诱导肿瘤细胞的凋亡，如TPL可以激活凋亡信号传导的关键分子caspase 3及p53，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)等多种信号通路来诱导肿瘤细胞凋亡[11,14-15]。本研究发现，经TPL作用后，小鼠H22腹水瘤细胞发生了典型的凋亡变化，提示TPL可以诱导H22细胞凋亡，且与对照组比较，经过TPL作用后的小鼠腹水量及腹水瘤细胞数均减少，生存期提高，表明TPL可能通过诱导H22细胞凋亡进而发挥抗肿瘤作用。

PD-L1也称B7-H1、CD274，是PD-1的配体之一，表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞等。有研究表明，PD-L1在多种人类肿瘤中高表达，如肝癌、卵巢癌、胃癌等。近年来研究表明，负性共刺激分子PD-L1 异常表达可以促使T细胞凋亡，从而抑制机体的免疫功能，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进了肿瘤细胞的生长。研究表明，沉默PD-L1的表达可以有效诱导A549癌细胞凋亡[16]，提示PD-L1蛋白可能与肿瘤细胞凋亡关系密切。PD-L1在淋巴瘤组织中高表达，并且可以促进肿瘤的生长，并能通过抗凋亡抵制顺铂对肿瘤的杀伤作用[17]。越来越多的证据表明，PD-L1可能成为预测肝癌进展和预后的新分子标志物, 阻断PD-L1/PD-1信号通路有望成为肝癌免疫治疗的新策略。本实验结果显示，不同剂量的TPL均可下调PD-L1的表达，且不同程度的诱导肿瘤细胞的凋亡，提示TPL抗肝腹水瘤作用可能与下调肿瘤细胞表面标志蛋白PD-L1有关，二者之间的内在联系有待进一步深入研究。