样本溶血对血浆中16种氨基酸测定准确性的探究

陈逢斌 任莹 赵胜军

摘要：为探究样本溶血对国标酸解法测定血浆中16种氨基酸含量的影响，采集60份断奶仔猪颈动脉血液并分为3组，即普通溶血组、机械溶血组与对照组，普通溶血组为血液采集后溶血样本，机械溶血组为血液采集后经超声波处理溶血再离心样本，未溶血血浆为对照组。采用赛卡姆S433D全自动氨基酸分析仪检测血浆样本中天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。结果表明，普通溶血组Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相较于其余两组显著升高（P<0.05），其余10种氨基酸含量相较于对照组偏高或偏低（P>0.05）。说明血样溶血对其氨基酸含量存在较大影响，且受非血红蛋白因素影响较小，为了尽可能避免或减少溶血的发生，建议采血操作以及样品的运送、分离检测严格规范，以提高测定的准确性。

关键词：血浆；溶血；氨基酸；准确性

中图分类号：R446.1 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）02-0005-03

血液樣本溶血会直接导致生化指标检测出现偏差，从而引发测定误差以及其他问题[1]。近年来，在医疗领域中血液氨基酸指标可用于筛查苯丙酮尿症、先天性甲状腺功能低下等疾病[2]，科研中作为血液标记物辅助诊断中枢神经系统肿瘤以及胃癌[3，4]，并可用于评估动物肠道健康以及营养物质代谢水平[5，6]。血液的特殊性致使测试血浆样本弥足珍贵，而在实际操作中却因溶血问题导致样本被弃用或者测定值不可用，给医疗和科研带来巨大损失。因此，探究血液样本溶血对其氨基酸含量的影响并加以分析能够使筛查或者评估更加精准。吴小平[7]对溶血导致临床生化检验结果偏差进行了研究，表明溶血对血液中葡萄糖、天冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶、尿酸等有显著影响。大量研究表明，溶血因素对血液指标测定准确性有较大影响，而分析原因后提出的校正方法主要是规避采血时的不规范操作，并利用回归方程校准数据[8-10]。在此基础上，本试验对血液样本溶血对茚三酮柱后衍生法测定氨基酸含量的影响以及是否因非蛋白基底因素影响氨基酸含量进行了探讨，并根据试验结果对溶血样品氨基酸测定进行了分析并提出了解决对策。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用血液样本来自30头21日龄断奶仔猪。

1.2 仪器和试剂

Sykam S433D全自动氨基酸测试仪，试剂均为Sigma试剂公司生产。

1.3 方法

将60份血液样本分为3组，即普通溶血组、机械溶血组及对照组，对照组为未溶血样本制得血浆，普通溶血组为采血后发生溶血样本制得血浆，机械溶血组为未溶血样本经超声波处理后再离心制得血浆。以超声波进行机械处理模拟因物理因素导致的溶血[11]，离心后从而排除溶血后血红蛋白因素的影响，探究是否因非血红蛋白物质及其他因素导致血液溶血后对氨基酸含量测定造成影响。

1.4 试验原理

酸水解法测定氨基酸具体方法按照GB/T 18246-2000执行[12]，测定血浆中天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）的含量。

1.5 数据的统计分析

试验数据使用Excel 2013统计整理，采用SAS软件包并选择GLM模型对数据进行ANOVA单因素方差分析。分析结果采用平均值±标准误表示，以P<0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

茚三酮柱后衍生测定水解氨基酸含量结果见表1。由表1可见，相较于对照组不溶血样本以及机械溶血组超声波溶血样本，普通溶血组即采集后发生溶血的血浆中Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量显著升高（P<0.05），且Thr、Ser、Glu、Gly、Phe、Pro、Arg的含量也偏高（P>0.05）；普通溶血组的Tyr、Met、Ile含量低于或等于对照组，但与机械溶血组无显著性差异（P>0.05）。机械溶血组的Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Leu、Phe、Pro、Lys、His、Arg含量均与对照组无显著性差异（P>0.05），但Tyr、Met、Ile含量却低于对照组（P>0.05）。

3 讨论

溶血，即红细胞破裂，致使血红蛋白散出到血浆或者血清中[13]。其主要表现为血浆或者血清颜色和密度的变化，一般为粉红色或者红色，溶血血浆中血红蛋白和其他生理成分增加，其密度受到影响[14]。而血红蛋白主要成分也是蛋白物质，在酸解法下分解为氨基酸或者小肽，导致血浆中氨基酸测定值偏高，这与本试验的大致趋势一致。动物机体中的Asp主要参与细胞代谢和生理作用，直接作用在于合成嘌呤、嘧啶以及其余可转氨作用合成的氨基酸[15]；而Ala主要参与能量供应的糖异生过程以及葡萄糖-丙氨酸循环，并在器官间的碳氮代谢和运输中起到重要作用[16]；Val作为生糖氨基酸可以进入三羧酸循环进行供能，且为蛋白质合成前体物质[17]；Leu主要功能为促进蛋白质合成[18]；His则直接为肌蛋白和球蛋白的组成成分[19]；Lys作为猪的第一限制性氨基酸可直接参与氮代谢中NO的合成[15]。这6个氨基酸涉及到机体各个器官的供能与氮代谢，从而也就说明为什么本试验中普通溶血组Asp、Ala、Val、Leu、His、Lys含量相较于对照组显著升高。但是普通溶血组中Met、Ile、Tyr的含量却小于或等于对照组，这可能与机体各个组织器官细胞的氨基酸基底含量和吸收利用量有很大关联[20]。而本试验中机械溶血组除Met、Ile、Tyr以外的其余13种氨基酸含量均与对照组无明显差异，由此可见在溶血过程中由非蛋白基底物质因素引起的变异较小，更多的可能来源于蛋白基底物质、采血速度或者采血时产生的泡沫等其他方面[21]。

溶血發生的原因比较复杂，有可能发生在采集过程中或者采集后储存过程中抑或是测定过程中[21]。首先可以明确的是，血浆的来源也就是动物机体的免疫状态对血浆中的各种应激物质或激素水平有很大影响；其次，在血液样本采集过程中有很多原因可以导致溶血：抽血针头大小、采集位点、进针角度、抽血速度、血液聚集过程中的泡沫问题以及运送过程的颠簸等；再者，储存不当或重复冻融以及解冻时的外界温度都可以对血液的溶血产生影响。而在实际血样指标测定过程中，有更多问题可以影响到最终结果，如测定周期长而且可能涉及到转移多次等问题。这也很好地印证了在某一项临床试验中调查显示溶血样本达到1.98%这一结果[22]。

总而言之，溶血的原因众多，但在国标水解法测定血浆中氨基酸的试验中大致可以排除血红素以及其他非血红蛋白因素的影响，更多的可能与红细胞破裂后释放的血红蛋白以及蛋白基底因素密切相关。以此对血浆样品氨基酸含量的测定提出建议：①动物试验中保证可控因素一致，减少机体免疫误差。②采集血样时统一位点并熟练操作、进针角度控制以及时刻关注血液流出速度、运送过程中确保平稳。③统一标准化储存、减少冻融次数。④减少转样次数，并及时上机测定。

4 结论

本试验得出如下结论：①相较于正常血浆，溶血样本中16种氨基酸含量绝大部分显著升高。②进一步研究表明溶血样本中非血红蛋白因素对氨基酸含量的影响较小。

参考文献：

[1] HUGHES N C，BAJAJ N，FAN J，et al. Assessing the matrix effects of hemolyzed samples in bioanalysis[J].Bioanalysis，2009，1（6）：1057-1066.

[2] 周艳和.新生儿疾病筛查足跟采血法的护理研究进展[J].中西医结合护理（中英文），2016，2（6）：217-219.

[3] 张春燕，程昱璇，赵振宇，等.基于代谢组学评价血液生物标志物对中枢神经系统肿瘤的诊断价值[J].标记免疫分析与临床，2017，24（6）：601-605.

[4] 修风民，张 凤，矫健鹏，等.胃癌患者血浆24种氨基酸代谢物水平变化[J].第二军医大学学报，2018，39（1）：62-67.

[5] 祝 倩，查 伟，姬玉娇.母猪饲粮添加脯氨酸对哺乳环江香猪血浆生化参数和氨基酸含量的影响[J].华南农业大学学报，2018，38（1）：7-11..

[6] 蔡万存，李向飞，蒋广震.大米蛋白替代鱼粉对团头鲂生长、肠道消化吸收功能以及氨基酸代谢的影响[J].南京农业大学学报，2017（3）：529-538.

[7] 吴小平.探讨溶血对临床生化检验结果的影响[J].中国医药指南，2018（10）：42-43.

[8] 谢绍霞.溶血对生化检验结果准确性的影响及校正方法分析[J].中外女性健康研究，2018，9（17）：111，166.

[9] 赵 东.溶血对生化检验结果准确性的影响及校正方法分析[J].检验医学与临床，2012，9（16）：2024-2025.

[10] 陈红琴.溶血对生化检验准确性的影响及纠正探析[J].现代诊断与治疗，2014，1（2）：387.

[11] 蔡 君.猪血生物法制备血红素及珠蛋白肽的工艺研究[D].武汉：湖北工业大学，2013.

[12] GB/T 18246-2000饲料中氨基酸的测定[S].

[13] 刘小娟，杜晓琳，黄 娟，等.生物分析中溶血对检测的影响及其对策[J].中国新药与临床杂志，2017（4）：7-11.

[14] LAGA A，CHEVES T，MAROTO S，et al. The suitability of hemolyzed specimens for compatibility testing using automated technology [J].Transfusion，2008，48（8）：8.

[15] WU G，BAZER F W，DAI Z，et al. Amino acid nutrition in animals：Protein synthesis and beyond[J].Annual Review of Animal Biosciences，2014，2（1）：387.

[16] FAN Q，YAN X，YIN Y，et al. Amino Acids，Gene Expression，and Cell Signaling in the Pig Intestine[C].Nutritional and Physiological Functions of Amino Acids in Pigs[M].Vienna：Springer，2013.

[17] MAVROMICHALIS I，KERR B J，PARR T M，et al. Valine requirement of nursery pigs[J].Journal of Animal Science，2001， 79（5）：1223-1229.

[18] ESCOBAR J，FRANK J W，SURYAWAN A，et al. Physiological rise in plasma leucine stimulates muscle protein synthesis in neonatal pigs by enhancing translation initiation factor activation[J].American Journal of Physiology Endocrinology & Metabolism，2005，288（5）：E914-921..

[19] PAN L，MA X K，WANG H L，et al. Enzymatic feather meal as an alternative animal protein source in diets for nursery pigs[J].Animal Feed Science & Technology，2016，212：112-121.

[20] ROMAN Y，BOMSEL-DEMONTOY M C，LEVRIER J，et al. Effect of hemolysis on plasma protein levels and plasma electrophoresis in birds[J].Journal of Wildlife Diseases，2009，45（1）：73-80.

[21] TAN A，GAGN？魪 S，L？魪VESQUE I A，et al. Impact of hemolysis during sample collection：How different is drug concentration in hemolyzed plasma from that of normal plasma？[J].Journal of Chromatography B，Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2012，901（none）：79-84.

[22] TANG D，THOMAS E. Strategies for dealing with hemolyzed samples in regulated LC-MS/MS bioanalysis[J].Bioanalysis，2012，4（22）：2715-2724.