基因拷贝数异常在甲状腺癌诊断和预后判断中的应用进展

曹星月 武晓泓

南京医科大学第一附属医院内分泌科 210029

近几十年来，甲状腺癌的发病率在全球范围内持续增长。中国国家癌症登记中心2009年至2011年的资料统计显示：2000年至2003年的年度发病率增加约4.9%，2003年至2011年显著上升至20.1%[1]。甲状腺癌按组织学类型分为乳头状甲状腺癌(PTC)、滤泡型甲状腺癌(FTC)、甲状腺髓样癌(MTC)和未分化癌，其中PTC最常见。尽管大部分甲状腺癌的预后良好，但是仍存在一部分高危患者容易转移、复发甚至死亡。因此，积极寻找甲状腺癌诊断和预后判断的相关指标至关重要。超声和超声引导下穿刺活检(FNA)是目前甲状腺癌术前最主要的诊断工具，但约25%的FNA细胞学诊断尚不能确定性质[2]。如今一批有价值的甲状腺癌分子标志物检测正在逐步进入临床，如BRAF、RAS点突变、RET/PTC和PAX8/PPARγ基因重组、P53、CTNNB1、PIK3CA、AKT1基因突变、TERT启动子突变、NTRK1基因重组、STRN/ALK基因融合等[3-4]。最近，研究显示不同类型甲状腺癌的基因拷贝数表现不同，并且与甲状腺癌的预后密切相关。现就基因拷贝数异常(CNVs)在甲状腺癌领域的研究进展作一综述。

1 CNVs简介

CNVs是广泛存在于人体基因组的一种结构变异现象。异常片段大小从几十个碱基(>50 bp)到数Mb范围不等，主要包括拷贝数的扩增、删除、缺失、插入、重组以及多位点的复杂变异。美国遗传学家Calvin Bridges于1936年首次在果蝇内发现CNVs，后续研究发现，在其他物种中也存在CNVs现象[5]。在此基础上人们发现，CNVs通过改变基因剂量、扰乱编码序列、干扰远程调控，直接影响和导致疾病的发生。CNVs主要有4大致病机制：(1)非等位基因同源重组(NAHR)，NAHR发生在减数分裂和有丝分裂，可导致染色体重复、缺失和倒置。(2)非同源末端重接(NHEJ)，主要是由于DNA断裂异常修复而导致相应DNA损害。(3)复制叉停滞和模版转换(FoSTeS)。(4)长散在核元件-1(LINE-1)介导的逆转录转座作用。LINE-1在逆转录转座过程中会出现异常插入现象，若这些异常插入发生在外显子或重要调节区域内则会导致DNA受损[5-6]。

目前检测CNVs的方法及适用范围见表1。截止目前，已经有大量研究强调CNVs是影响人类表型的一个重要因素，并且发现CNVs与疾病的形成与预后相关。相关研究认为CNVs作为危险因素，能够增加人类感染免疫缺陷病，罹患神经精神疾病的风险。此外CNVs与一些特殊疾病，如多发性先天性异常综合征、阿尔兹海默症、智力残疾、骨质疏松、自闭症等的形成有关[7-8]。近年来许多研究证实CNVs同样参与肿瘤的发生、发展以及转归，如肺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌等[9-12]。

表1 CNVs的检测方法及其适用范围

注：CNVs：拷贝数异常；FISH法：荧光免疫杂交法；RT-qPCR：实时荧光定量PCR；SNP：单核苷酸多态性；aCGH：比较基因组杂交技术；oaCGH：寡核苷酸芯片技术；BAC：细菌人工染色体克隆；MAPH：多重扩增探针杂交技术；MLPA：多重探针扩增技术；NGS：二代测序；RD法：读断深度法；RP法：读断配对法；SR法：读断分解法；AS法：重装配法

2 CNVs在甲状腺癌诊断中的价值

随着二代测序技术的发展，甲状腺癌的个体化肿瘤基因组检测变得更加可行。2011年，Da Silva等[21]对1例FTC患者进行了DNA拷贝数检测。该患者的肿瘤存在一系列组织学表现(微滤泡样、大滤泡样、假乳头样、嗜酸样以及其他分化更差的结构)。结果发现，这些结构均存在11q、17q扩增现象，其克隆起源是一致的。其中，滤泡样结构仅存在11q、17q扩增，而嗜酸样结构的CNVs种类最多(1p、7q、11q、12q、17q扩增，1p、16q缺失)，提示11q和17q扩增为肿瘤的早期改变，而其他类型的CNVs可能是后期亚克隆产生，与肿瘤的进展相关。随后，Liu等[22]对39例甲状腺肿瘤患者进行CNVs测序，其中14例为甲状腺腺瘤(FA)，13例滤泡型乳头状癌(FVPTC)，12例PTC。结果发现，12号染色体扩增现象仅存在于FA，而22号染色体缺失常见于FA和FVPTC。通过术前检测CNVs可以辅助判断甲状腺结节的良、恶性。Hess等[23]通过检测曾有放射性物质接触史的PTC患者与散发性PTC患者的CNVs，发现前者普遍存在7q11.22-11.23片段扩增，并且由11.23片段编码的CLIP2基因mRNA和蛋白水平表达增加。因此，7q扩增和CLIP2基因可作为放射性PTC的新型分子标志物。Ye等[24]认为甲状腺良、恶性结节的克隆起源不同，其在PTC患者中检测到22q缺失现象，但在甲状腺良性结节患者中却未发现此变异。

3 CNVs在甲状腺癌预后判断中的应用价值

大量研究证实，CNVs与甲状腺癌的预后密切联系。癌症基因组图谱研究团队认为甲状腺癌可根据CNVs分为4大类：第一类为未见CNVs异常型(SCNA-quiet)，此类最常见；第二类为22q缺失型(SCNA-22q-del)，此类最常见于FVPTC；第三类为1q扩增型(SCNA-low-1q-amp)，此类通常恶性程度较高；第四类为高频率点扩增与点缺失(SCNA-high)。此分类法表现出CNVs与甲状腺癌的预后相关。此外，7号染色体34片段改变可导致BRAF基因融合突变，10号染色体23.31片段缺失可致PTEN基因低表达，提示CNVs可能参与PTC的发生与发展[25]。根据基因表达图谱的类型，Yoo等[26]将甲状腺肿瘤分为类BRAF型(BRAF-like)、类RAS型(RAS-like)和非BRAF/RAS型(NBNR)3大亚型。22号染色体缺失最常见于类RAS型，且发生甲状腺多灶癌的可能性大。18p扩增更易出现在类BRAF型，易并发淋巴细胞性甲状腺炎。12号染色体扩增较常见于FA和惰性甲状腺肿瘤。相比于低侵袭性FTC和FVPTC，经典型PTC(cPTC)的CNVs最少见。美国癌症联合委员会和美国甲状腺协会一致认为染色体拷贝数扩增常见于甲状腺癌较高危组，染色体拷贝数缺失常见于甲状腺癌低危组。在PTC范围内，大多数拷贝数扩增发生在2q35、4q26/34.1，大部分拷贝数删除则出现在6q25.2。其中，2q35、4q26/34.1拷贝数扩增致FN1、PDE5A基因表达增加。因此，FN1、PDE5A过表达与PTC的进展有关[27]。Ciampi等[28]发现65例MTC患者中27.7%存在RET CNVs，其中散发性MTC患者常仅表现为chr10q拷贝数增加，而遗传性患者则表现为RET基因扩增。RET CNVs更常见于RET突变型MTC，此类患者预后更差。Liang等[29]在中国人群PTC中发现1号染色体位点倒位形成的NTRK1/IRF2BP2融合突变现象可作为PTC患者的复发指标。一项有关日本PTC人群的CNVs检测结果显示，在致癌性基因突变(BRAF V600E、RET/PTC1)阴性的PTC患者中CNVs高发，因此，CNVs参与甲状腺癌的形成过程，尤其是致癌基因突变阴性的患者[30]。近年来不乏有研究认为，CNVs不仅影响甲状腺癌基因表达、表型变化，甚至还参与肿瘤的形成过程[31-32]。通过检测CNVs同样也可以指导甲状腺癌患者的治疗。Duquette等[33]在BRAF V600E突变型PTC患者中检测到1q扩增现象，并通过免疫组化技术检测出MCL-1基因高表达。研究发现，与维洛菲尼单一疗法相比，维洛菲尼联合BCL-1/MCL-1抑制剂可以消除肿瘤细胞对维洛菲尼的耐药反应，从而提高靶向治疗的疗效，见表2。

近年来CNVs是各个肿瘤领域广泛关注的焦点。显然CNVs与人类疾病之间的内在联系不可忽视。在甲状腺癌领域，研究发现不同类型的甲状腺癌CNVs不同，并且CNVs与甲状腺癌的预后密不可分。通过检测异常染色体上相关基因的表达情况，可辅助甲状腺癌的诊断和预后判断。目前的问题在于，不同检测方法的差异性以及特异性甲状腺癌CNVs和相关分子标志物的确定。随着CNVs检测技术的逐渐成熟，其致病机制以及与基因突变的关系一定会被广泛认识。CNVs有望为甲状腺癌诊断和预后判断提供新的方向。

表2 甲状腺癌CNVs及其相关基因

注：CNVs：拷贝数异常；FA：甲状腺腺瘤；SNP：单核苷酸多态性；amps：扩增；PTC：甲状腺乳头状癌；aCGH：比较基因组杂交技术；dels：删除；Radiation-associated PTC：辐射相关性甲状腺乳头状癌；loses：缺失；invs：倒位；NGS：二代测序；FVPTC：滤泡型甲状腺乳头状癌；FTC：甲状腺滤泡状癌；MTC：甲状腺髓样癌；FISH法：荧光免疫杂交法