一个新型牛樟芝PR-PKS基因的克隆及表达分析

原晓龙， 华 梅， 陈 剑， 王 娟， 杨宇明， 王 毅

(云南省林业科学院 云南省森林植物培育与开发利用重点实验室 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室, 云南 昆明 650204)

聚酮化合物(Polyketides, PK)是一类重要的次生代谢产物，已有7 000余种聚酮类化合物结构确定，市面上聚酮类药物已超过20种[1-2]。聚酮化合物由聚酮合酶(Polyketides synthase, PKS)催化合成，其催化过程与脂肪酸合成类似，即通过在不同的脂酰基-CoA活化底物间重复缩合进而形成数量庞大、结构丰富的次生代谢产物[3-4]。真菌PKS主要属于Ⅰ型聚酮合酶，根据其所拥有结构域可将真菌Ⅰ型PKS分为非还原型PKS (Non-reducing PKS，NR-PKS)、部分还原型PKS (Partial-reducing PKS，PR-PKS)、高度还原型PKS (Highly-reducing PKS，HR-PKS)[5-6]。NR-PKS催化β-酮链发生环化反应，形成单环或多环芳香聚酮类化合物，如苔色酸(orsellinic acid)[7]、黑色素(melanin)[8]、降散盘衣酸 (nonsolorinic acid)[9]等；HR-PKS催化数量庞大的线性或环状非芳香族聚酮化合物的合成，如洛伐他汀(Lovastatin)[10]、伏马菌素(Fumonisin)[11]、T-毒素(T-toxin)[12]等；迄今为止，在PR-PKS中，仅确定6-甲基水杨酸(6-methylsalicyclic acid)由其催化合成[13-15]。目前PR-PKS中仅6-甲基水杨酸合成酶(6-methylsalicyclic acid synthases，6-MSAS)有相关的研究报道。6-MSAS是最先从展青霉(Penicilliumpatulum)中发现并提纯的PKS[16]，其结构类似哺乳动物的脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS) ，其N端为β-酮基合成酶(Keto synthase，KS)、酰基转移酶结构域(Acyl transferase，AT)、脱水酶(Dehydratase，DH)、β-酮基还原酶(Keto reductase，KR)，其C末端含有ACP结构域，而没有如硫酯酶释放结构域(Thioesterase，TE)、环化酶(Cyclase，CYC)等酯酶释放结构域[17]。因为6-MSAS中缺少ER结构域,使酮基侧链还原不彻底，所以将其归类为PR-PKS[18]。根据系统发育树的分析，6-MSAS和其他未鉴定的PR-PKS，与真菌NR-PKS、HR-PKS的关联程度较低，而与细菌的Ⅰ型PKS关联较为密切[5,19]。与细菌比较，真菌聚酮化合物的生物合成研究进展极其缓慢。主要因为在操作真核生物的过程中，其遗传操作转化体系复杂、有效酶制剂缺乏、真核生物自身含较大基因组和内含子等[18,20]。随着新的分子生物学工具、二代测序技术的应用，极大地促进了真菌聚酮化合物生物合成的研究进程。通过挖掘真菌基因组中潜在基因簇的方式，能极大地加速真菌天然次生代谢产物的研究和开发进程[21-22]。从真菌基因组挖掘能产生新活性化合物和酶结构的生物合成途径已成为当前研究的一个热点[23]，通过采用不同的培养方式能够有效激活沉默或潜在的基因簇，获得不同的天然次生代谢产物(“一菌多产物”策略)，元超等[24]利用PDB培养基从地衣内生真菌Myxotrichumsp.中培养获得柠檬菌素和褐菌素的独特骨架；利用大米培养基获得了3种聚酮化合物(myxotritones A～C)和1个新的天然产物(7, 8-dihydro-7R, 8S-dihydroxy-3, 7-dimethyl-2-benzopyran-6-one)。2014年牛樟芝基因组测序工作已完成[25]，为研究牛樟芝中PKS基因与具体聚酮化合物之间的联系，本研究通过对牛樟芝基因组数据分析，分离并克隆得到牛樟芝中的聚酮合酶基因(AcPKS3)的全长cDNA，然后采用生物信息学方法[26]分析AcPKS3基因；将牛樟芝菌丝体在含有不同碳氮源添加物的培养基上培养一段时间后，再测定AcPKS3基因的具体表达量，以期为下一步牛樟芝聚酮合酶基因的异源表达、AcPKS3基因和具体化合物的联系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 牛樟芝菌株从购自我国台湾省的生长在椴木上的牛樟芝子实体中分离获得，经形态和ITS鉴定该菌株为牛樟芝，菌株编号为LKYAC01。

1.1.2 培养基 表达培养基及其主要成分见表1，扩繁培养基采用麦芽糖酵母提取物培养基(malt yeast extract，美国BD)。

1.1.3 试剂 试剂盒：植物RNA提取试剂盒(康为世纪)，总RNA参照反转录试剂盒(Transgen)，高保真DNA聚合酶(Transgen)。

1.1.4 仪器与设备 NanoDropTM2000紫外分光光度计(Thermo Fisher，美国)，Azure C300凝胶成像系统、C1000 Touch PCR热循环仪、电泳仪(Bio-Rad，美国)，SHP-450恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 牛樟芝AcPKS3基因全长的克隆 将25 ℃条件下培养40 d的牛樟芝菌丝体，用植物RNA提取试剂盒提取牛樟芝总RNA，用NanoDropTM2000紫外分光光度计测量RNA的浓度和质量，并将RNA反转录成cDNA，-80 ℃保存。通过对牛樟芝基因组数据搜索获得一个与聚酮化合物生物合成相关的基因AcPKS3，利用在线程序GENE Fisher分别设计含有起始密码子(AcPKS3F0)和终止密码子(AcPKS3R0)的引物(表2)，以牛樟芝cDNA为模板用高保真DNA聚合酶进行克隆，对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段并将其与克隆载体连接，筛选阳性克隆进行测序。

表1 培养基配方

1.2.2AcPKS3基因及其蛋白质的生物信息学分析 利用NCBI在线程序ORF Finder进行开放阅读框预测，用BLAST程序进行序列同源性比较，ProtParam进行蛋白质理化性质(等电点、分子量)分析，SignalP 4.1 server预测该蛋白序列中是否含有信号肽，Target P预测该蛋白存在于细胞中的部位，用NCBI中的CDD程序分析AcPKS3蛋白的功能域。选取与牛樟芝AcPKS3蛋白质序列同源性较高的其他真菌的PKS蛋白序列一起，用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列同源性分析及系统发育分析，进行Clustal W程序比对后，采用Neighbor-Joinging 程序构建进化树，自检值采用1 000次重复，其他参数选用默认值。生物信息学所用在线工具及其网址见表3。

表2 PCR反应引物

表3 生物信息学在线工具及其网址

1.2.3 牛樟芝AcPKS3基因在不同培养基上的表达分析 根据项目组之前的研究结果，不同的碳氮源添加物及配方能够显著影响牛樟芝菌丝体的生长速度[27]，选取能够促进牛樟芝菌丝体生长的培养条件和配方作为AcPKS3基因表达的培养基(表1)。将牛樟芝菌丝体接种在不同配方的培养基上，25 ℃恒温培养40 d后，从各培养基上收获0.5 g牛樟芝真菌菌丝体，重复3次取样。依据真菌RNA提取试剂盒提取牛樟芝菌丝体的总RNA。牛樟芝菌丝体的总RNA参照反转录试剂盒说明书合成第一条链cDNA，并于-20 ℃保存备用。然后，以引物(表2)检测牛樟芝AcPKS3基因在不同培养基上的具体表达情况，进行琼脂糖凝胶电泳检测后，利用图像分析软件GENE-SNAPS测量不同条带的积分光密度值，以actin电泳条带作为标准与各电泳条带进行比较，采用各目的条带与各培养基上actin电泳条带的比值绘制柱状图，进行相对定量表达分析。

2 结果与分析

2.1 牛樟芝AcPKS3基因全长的获得

以牛樟芝真菌菌丝体RNA反转录cDNA为模板，以AcPKSF0和AcPKSR0为引物，利用高保真聚合酶 ( HiFi-DNA polymerase ) 进行PCR扩增获得1条长度约为7 kb的片段，经回收、克隆、测序获得6 858 bp的完整ORF序列。BLAST比对分析显示，该基因与密褐褶孔菌(Gloeophyllumtrabeum，XM_007871264)、根状锁孔菌(Fibroporiaradiculosa，XM_012329146)、污叉丝孔菌(Dichomitussqualens，XM_007368075)的DNA序列一致性分别达78%、73%和72%，并将该基因命名为AcPKS3(GenBank登录号：MG988206)。通过比对AcPKS3基因的DNA序列及cDNA序列(图1)，显示该基因含有22个内含子，23个外显子，共编码2 285个氨基酸。

图1 牛樟芝AcPKS3基因中内含子和外显子的分布示意图Fig.1 The schematic diagram of the distribution of the introns and exons of AcPKS3 gene in T. camphoratus

2.2 AcPKS3蛋白结构及其序列分析

用Protparam预测AcPKS3蛋白中氨基酸残基序列的理化性质，其相对分子质量为260.0 kDa，理论等电点5.79，结构式C11593H18247N3167O3452S76，不稳定系数为39.26(Ⅱ级)，是一种较稳定蛋白；脂肪酸系数为92.44，平均亲水性为-0.092。SignalP 4.1 server分析显示AcPKS3蛋白不存在信号肽。Target P分析结果显示该蛋白存在于细胞质基质中。CDD分析结果显示该蛋白的结构域依次为KS-AT-KR-ACP-SDR，其KR结构域负责C环中位于C4位聚酮侧链β-酮基的还原。将牛樟芝AcPKS3与其他部分还原型聚酮合酶对应的结构域进行比对发现AcPKS3的5个结构域其活性保守位点分别为β-酮基合成酶(DTACSS)、酰基转移酶(GHSAGETA)、酮基还原酶(YLLVGGIG)、酰基转移酶(YGLDSITSA)、短链脱氢酶(Short chain sehydrogenase)中与NAD(P)H结合的N端保守序列(ITGTTGSFG)及催化活性保守序列(YTESK)(图2)。

2.3 AcPKS3蛋白的分子系统进化分析

利用MEGA 6.0的Clustal W程序对牛樟芝AcPKS3和其他44条真菌PKS蛋白序列进行比对后，利用Neighbor-Joining算法建树(图3)，结果显示：这些真菌的PKS蛋白序列可分还原型PKS和非还原型PKS，其中还原型又可分为HR-PKS和PR-PKS；牛樟芝与密褐褶孔菌(G.traberum, XP_007869455)、污叉丝孔菌(D.squalens, XP_007365620, XP_007368137)聚为一支，位于PR-PKS部分；该分支与6-MSAS分支即灰黄青霉(P.griseofulvum, CAA39295)、扩展青霉(P.expansum, XP_016595371)、棒曲霉(A.clavatus, EAW11667)、赤曲霉(A.ruber, EYE91246)、大田节皮菌(A.otea, XP_002849666)和石膏样奈尼兹皮真菌(N.gypsea, XP_003169413)相邻，亲缘关系较近，该分支的结构域依次为KS-AT-DH-KR-ACP。

2.4 不同碳氮源添加物对牛樟芝AcPKS3基因表达的影响

根据项目组之前的研究，牛樟芝菌丝体在不同培养基上生长速度差异较大[27]。将牛樟芝菌丝体在17种不同培养基上培养，其中1号为基础培养基，2～5号在基础培养基上添加不同碳源，6～11号以共同的碳源(麦芽糖1.8 g/L, 葡萄糖6 g/L)为基础添加不同氮源，12～17号为不同的商业培养基。25 ℃恒温培养40 d后，提取RNA反转录成cDNA，并用特异引物(表2)检测其表达情况。结果显示(图4和图5)：在不同碳源添加物的试验中(1～5号培养基)，仅葡萄糖能诱导AcPKS3基因的表达，而在其余添加不同碳源培养基上不表达；在不同氮源添加物的试验中(6～11号培养基)，以碳源添加物葡萄糖作为基准，牛肉浸粉、酪蛋白胨、土豆蛋白胨的表达量高于葡萄糖，能够促进AcPKS3基因的表达，而酵母提取物、番茄浸粉、胰蛋白胨的表达量低于葡萄糖，对AcPKS3基因的表达具一定的抑制作用；其中土豆蛋白胨的促进作用最强，胰蛋白胨的抑制作用最强；同时采用不同的商业培养基检验该基因的表达情况，结果显示,表达量从高到低依次为YMB、WB、TMG、PDA、SA、MEB。

图2 AcPKS3不同结构域活性保守位点分析Fig.2 Alignment of T. camphoratus predicted polyketide synthase(AcPKS3) active regions with five closely related fungal PKSsAC:牛樟芝(MG988206)； FR: 根纤维孔菌(XP_012177563.1)；GT: 密褐褶孔菌(XP_007869455.1)；DS: 污叉丝孔菌(XP_007365620.1)；框内为保守氨基酸AC: T. camphoratus (MG988206); FR: Fibroporia radiculosa (XP_012177563.1); GT: Gloeophyllum trabeum (XP_007869455.1); DS: Dichomitus squalens (XP_007365620.1)； the conserved amino acids residues were located in the box

图3 牛樟芝AcPKS3与44个真菌PKS蛋白序列的系统进化分析Fig.3 Phylogenic analysis of AcPKS3 in T. camphoratus with another 44 fungal proteinic sequences

图4 不同培养基条件下牛樟芝AcPKS3基因的表达量Fig.4 The expression levels of gene AcPKS3with different mediumA: 以麦芽糖6 g/L、 酵母提取物3 g/L为基础，碳源依次为不添加、甘露糖4 g/L、乳糖4 g/L、葡萄糖4 g/L、果糖4 g/L；B: 以麦芽糖1.8 g/L、葡萄糖6 g/L为基础，氮源依次添加牛肉浸粉4 g/L、胰蛋白胨4 g/L、酵母提取物4g/L、番茄浸粉4 g/L、酪蛋白胨4 g/L、土豆蛋白胨4 g/L；C: 不同商业培养基A: The basic media consists of Maltose 6 g/L, Yeast extract 3 g/L, the carbon sources are Mannose 4 g/L, Lactose 4 g/L, Glucose 4 g/L, Fructose 4 g/L, respectively; B: The basic media consists of Maltose 1.8 g/L, Glucose 6 g/L, nitrogen sources are Beef extract powder 4 g/L, Tryptone 4 g/L, Yeast extract 4 g/L, Tomato extract 4 g/L, Casein 4 g/L, Potato extract 4 g/L, respectively; C: Different commercial medium

图5 不同培养基条件下AcPKS3基因的扩增结果Fig.5 The gel electrophoretogram of AcPKS3 gene amplication products in the different mediumM: 2 000 Marker；1～5为不同碳源添加物，1：不添加，2：添加甘露糖，3：添加乳糖，4：添加葡萄糖，5：添加果糖；6～11添加不同氮源，6：添加牛肉浸粉，7：添加胰蛋白胨，8：添加酵母提取物，9：添加番茄浸粉，10：添加酪蛋白胨，11：添加土豆蛋白胨；12～17为不同商业培养基M: 2 000 Marker; 1-5 add different carbon additives to the basic media, 1： none, 2： mannose,3： lactose, 4： glucose, 5： fructose; 6-11 add different nitrogen additives to the basic media, 6： beef extract powder, 7： tryptone, 8： yeast extract, 9： tomato extract, 10： casein, 11： potato extract; 12-17 are different commercial medium

3 讨 论

牛樟芝(T.camphoratus)是多孔菌科(Polyporaceae)薄孔菌属(Antrodia)真菌，为我国台湾地区所特有的珍贵食药两用真菌[25,28]。牛樟芝中含有丰富的生理活性物质，如牛樟芝子实体中特有的聚酮化合物安卓凯因A (antrocamphin A)[29-30]。本研究通过对牛樟芝基因组分析，获得牛樟芝部分还原型PKS基因AcPKS3，并对其进行分析。关于聚酮合酶基因与具体化合物之间联系的报道目前尚未发现，本研究的目的是从牛樟芝基因组中分离聚酮合酶基因，并研究其在不同培养条件下的表达状况，最后确定基因与化合物之间的联系。

本研究通过对AcPKS3基因及其蛋白序列进行生物信息学分析，其中结构域分析得知AcPKS3蛋白中含有β-酮基还原酶(KR)，能还原聚酮骨架侧链中的特定β-酮基侧链，亦含有C末端酶释放结构域短链醇脱氢酶(Short Chain Dehydrogenase，SDR)；该蛋白结构与6-MSAS的组成不同，无DH结构域，含末端酯酶释放结构域SDR；AcPKS3蛋白序列中存在于NAD(P)H结合的N端序列(GXXXGXXG)和催化活性保守序列(YXXXK)，这两个序列是SDR的典型识别序列[31]；SDR结构域与其他TE结构域在聚酮合酶中的位置和功能基本相似，均位于C末端，催化醇的氧化、醛酮的还原等并释放聚酮化合物[32-33]；其他TE结构域如C-末端还原酶释放结构域(R)[5]、C-末端酯酶/类脂肪酶(EST)结构域[34]，类金属-β-内酰胺酶(MβL)水解酶[35]等酶结构域的功能已通过试验得到验证，如Fujii等[36]通过异源过量表达wA-PKS基因修饰过的C-末端首次证明TE结构域参与克莱森环化反应，该结构域又被命名为克莱森式环化酶结构域(CLC)，参与构巢曲霉(Aspergillusnidulans)中WA聚酮合酶催化萘并吡喃酮(naphthopyrone)第二个芳香环的克莱森式环化；R结构域的催化还原释放作用已通过异源表达得到确认[37]；EST结构域略大于TE/CLC结构域，属丝氨酸水解酶家族[34]；通过基因敲除的方式证明MβL结构域参与构巢曲霉中AptA(asperthecin PKS)聚酮产物的释放[38]。结构域分析结合系统进化树分析，该蛋白含有KR结构域，且与6-MSAS亲缘关系较近，可推测该酶为一种新型的PR-PKS。

不同培养基和培养方式对牛樟芝生长速度及其活性组分均有显著影响[27,39]，另外同一基因在不同培养条件下，其基因表达会出现差异，且有可能会产生不同的化合物，这一现象可通过“一菌多产物”(One Strain Many Compounds, OSMAC)解释。Hemphill等[40]利用“一菌多产物”策略成功地从内生真菌三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)中获得5种化合物，2种新化合物(fusarilelin K和fusarilelin L)及2种已知化合物(fusarilelin A和fusarilelin B)，并将化合物fusarilelin J的量增加了80倍。本研究应用含不同碳氮源添加物和商业培养基诱导AcPKS3基因的表达，发现在不同碳源中仅葡萄糖能诱导AcPKS3基因的表达；在不同氮源添加物试验中，土豆蛋白胨促进诱导表达的作用最强，而胰蛋白胨的抑制作用最强；不同商业培养基测试表明YMB表达量最高，而MEB表达量最低。该结果说明牛樟芝AcPKS3基因在不同培养基上的表达水平存在明显差异，本研究能够为下一步通过大规模发酵的方式研究和获取新的部分还原型聚酮化合物提供了最佳培养基。本研究有助于牛樟芝聚酮类化合物的异源表达，为提高牛樟芝聚酮化合物的合成效率及基因调控分析提供参考。