高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼生长及非特异性免疫力的影响

◆作者：魏逸峰成艳波陈金涛谭文俊张 丽 史合群

◆单位：1.广东省微生物研究所，广东广州510070；2.广东碧德生物科技有限公司，广东广州510063；3.广东省部共建华南应用微生物国家重点试验室，广东广州510070；4.广东省微生物应用新技术公共试验室，广东广州510070；5.广东省菌种保藏与应用重点试验室，广东广州510070；6.广州市科虎生物技术研究开发中心，广东广州510663

黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco（属鲶形目（Siluriformes）、鲿科（Bagridae）、黄颡鱼属（Pelteobagrus Bleeker），体色艳丽、肉质鲜嫩，是一种优质名贵经济鱼类。本研究通过诱变与筛选出高产乳酸的新型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌株耐高温、耐胃酸和胆盐。通过将该菌株加工成微生物制剂，并以不同剂量添加到黄颡鱼饲料中，探究高产乳酸芽孢杆菌制剂对黄颡鱼生长和免疫的影响，为该菌剂产业化应用提供技术支撑和理论依据，对水产养殖业可持续发展也将具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼

试验鱼购自广东花都区花东镇，为性状优良全雄苗种，试验开始前经驯化暂养，挑选规格一致的健康黄颡鱼进行试验。

1.1.2 基础饲料

广州番禺灵川饲料有限公司成品黄颡鱼配合饲料（1号料）。

1.1.3 菌剂

高产乳酸芽孢杆菌制剂，浓度≥1.0x109cfu/mL；

1.1.4 主要试剂

南京建成A001-1-1总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、南京建成A050-1溶菌酶（LZM）检测试剂盒等。

1.2 试验条件

试验在广东微生物研究所养殖试验室进行，试验配备体积为1m3鱼缸进行养殖。鱼缸设有增氧装置，进排水装置，24 h连续充气。每天投喂2次（08：00和18：00），日投喂量为总重的 3%，每2周进行一次称重，调整日投喂量。采用少量多次的人工饱食投喂。试验结束后，禁食1天，进行生长指标测定及样品采集。整个试验周期水温的变化范围为25℃～29℃，水体pH变化范围为7.0～7.5，溶氧＞ 5.0 mg/L。试验采用人工光照，每天光照时间为12h 光照、12 小时黑暗（8：00、20：00）。各组定期换水，吸取池底残饵、粪便、捞取死鱼计数。

表1 各试验分组饲料的处理方法

1.3 试验分组

试验设对照组1组（CK），试验组 3 组（B-02、B-10、B-50），处理方法如表1所示。

对照组、试验组各设3个缸，4组共计12缸。试验所用基础饲料为黄颡鱼配合饲料，成分如表2，试验饲料为喷涂了高产乳酸芽孢杆菌的饲料。高产乳酸芽孢杆菌制剂稀释至饲料重量的 10%（v/w），现喂现喷，风干后投喂，以保证菌数达标。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 血清样品采集方法

黄颡鱼样品采集：取样前将实验鱼用MS-222麻醉，浓度为25 mg/L，时间为 15～20min，若鱼体呈正常游动状态，保持静止不动，有声响时仅尾部轻微摆动，轻触头部时反应迟钝，用手去抓时不能及时逃避，表明麻醉成功。每个试验池随机取20尾鱼，称重后取10尾用1mL无菌注射器从黄颡鱼尾静脉内抽血，在4℃以下保存 12h，5000 r/min冷冻离心10 min，取上清液-80℃保存备用。

1.4.2 指标测定方法

1.4.3 数据统计分析

使用SPSS 20.0软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼生长性能和饲料效率的影响

由表3可见，结果显示：黄颡鱼生长性能方面，投喂添加高产乳酸芽孢杆菌饲料的BS-02、BS-10、BS-50组各项生长指标优于对照组CK。相比对照组，添加芽孢杆菌1.0%的BS-10组黄颡鱼增重率显著提高12.93%（P＜0.05）、特定生长率显著提高8.70%（P＜0.05）、蛋白质效率显著提高 9.30%（P＜0.05）、饲料系数显著降低 8.54%（P＜0.05）；添芽孢杆菌5.0%的BS-50组黄颡鱼增重率显著提高12.57%（P＜0.05）、特定生长率显著提高8.70%（P＜0.05）、蛋白质效率显著提高 8.03%（P＜0.05）、饲料系数显著降低 7.28%（P＜0.05）。

表2 基础饲料配方及营养成分

表3 高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼生长的影响

2.2 高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼血清非特异性免疫的影响

由表4可见，结果显示：相比对照组，BS-02组溶菌酶活力提高4.29%、BS-10组溶菌酶活力提高12.58%，差异显著（P＜0.05）、BS-50组溶菌酶活力提高8.59%。

相比对照组，BS-02组超氧化物歧化酶活力提高21.31%，差异显著（P＜0.05）、BS-10组超氧化物歧化酶活力提高13.57%、BS-50组的超氧化物歧化酶活力提高12.55%。

表4 黄颡鱼血清非特异性免疫酶活力

3 讨论

3.1 高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼生长性能的影响

江永明等人（2011）研究表明，饲料中分别添加枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌饲喂奥尼罗非鱼，都能显著提高（P＜0.05）增重率，显著降低（P＜0.05）饵料系数，显著提高（P＜0.05）饲料干物质和饲料蛋白质的表观消化率。刘翠玲（2015）的研究表明，饲料添加枯草芽孢杆菌可以显著（P＜0.05）提高鲤鱼幼鱼生长和消化酶活性，并可显著改善其免疫相关酶的活性。以上研究与本研究结果相互验证，投喂高产乳酸芽孢杆菌饲料，对黄颡鱼末重、特定生长率、饲料系数、成活率具有促进作用，但不产生显著影响，当添加量达到1.0%及5.0%时能显著提高黄颡鱼特定生长率、蛋白质效率，提高黄颡鱼对饲料的利用率，总体上看，添加高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼生长具有促进效果。原因是产乳酸芽孢杆菌的代谢产物包括多种氨基酸、酶类、乳酸等活性物质，具促进鱼类消化吸收、修复肠道、增强动物免疫等功能。

3.2 高产乳酸芽孢杆菌对黄颡鱼血清非特异性免疫酶活力的影响

鱼类的非特异性免疫机制在其防御外来病原入侵的过程中起着非常重要的作用。溶菌酶能破坏和消除侵入体内的异物，从而担负起机体防御的功能。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶之一，可以清除体内多余的自由基，与生物的免疫水平呈密切相关，也能反映动物的抗应激能力，因此这两种酶是评判机体非特异性免疫力关键指标。黄燕华等（2014）的研究表明，饲料中添加鼠李糖乳杆菌和粪肠球菌能显著（P＜0.05）提高奥尼罗非鱼免疫、抗氧化能力及抗嗜水气单胞菌感染能力。刘小玲等（2013）的研究表明饲料中添加嗜酸乳酸菌可一定程度提高吉富罗非鱼血清SOD和AKP活性，降低肠道中细菌总数，抑制大肠杆菌生长。本研究结果显示，添加了高产乳酸芽孢杆菌的BS-02、BS-10、BS-50 组黄颡鱼非特异性免疫酶活力均高于对照组，其中BS-10溶菌酶活力显著高于对照组（P＜0.05），BS-02超氧化物歧化酶活力显著高于对照组（P＜0.05）。推测原因主要由于高产乳酸芽孢杆菌可能会刺激鱼类肠黏膜免疫的表达，从而提高了血清抗氧化和免疫力，特别是抗氧化能力，增强了鱼机体的抗病原感染能力。