模拟氮沉降和增温对荒漠草原土壤细菌群落组成和多样性的影响

黄 静，杨英花，张国刚，贾美清，韩国栋

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学 天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387；3.内蒙古农业大学 草原与资源环境学院，呼和浩特 010019）

氮沉降和气候变暖已成为全球气候变化的2个主要特征[1].到21世纪末陆地气候会继续变暖，平均地表温度将升高1.8～4.0℃[2].20世纪由于人类活动导致的大气氮沉降已增加了3～5倍[2]，据预测到2050年氮沉降的速率将会翻一番[3].Jia等[4]基于1980—2010年公开发表数据的分析表明，中国大气氮沉降的平均值已由每公顷11.11 kg上升到每公顷13.87 kg，增加了近25%.在全球气候变暖的大环境下，近50 a我国草原区气候明显变暖[5]，内蒙古草原生态系统的氮沉降量也已达到了每年0.4～0.6 g/m2[6]，氮沉降和气候变暖已成为内蒙古草原面临的主要环境问题.内蒙古荒漠草原属于典型草原向荒漠过渡的植被类型，是内蒙古草原的重要组成部分，在畜牧业生产和维持生态平衡等方面发挥着重要作用.近年来，由于气候变化以及过度放牧等人为干扰，荒漠草原出现了严重退化，草地的服务功能受到了严重威胁.

土壤微生物直接参与土壤的生物地球化学循环过程，在土壤碳循环中发挥着重要作用[7].目前，气候变化对荒漠草原影响方面的研究以地上植物群落的结构和多样性居多[8-9]，在土壤特性[10]、土壤呼吸[11]等方面也取得了一些研究成果.土壤微生物的多样性和群落结构的稳定性是实现生态系统功能的重要因素.本课题组前期对内蒙古荒漠草原土壤微生物的空间分布特征进行了初步研究[12-14].为了实现气候变化大背景下对荒漠草原的合理管理和可持续利用，本研究通过人工施肥模拟氮沉降和远红外线辐射器加热模拟气候变暖，经过连续6 a的模拟实验后，采用稀释平板涂布法和16S rRNA分子鉴定技术探究了氮沉降和气候变暖对内蒙古荒漠草原土壤可培养细菌群落组成和多样性的影响.

1 材料与方法

1.1 样地概况和设计

样地位于内蒙古自治区乌兰察布市农牧科学院四子王旗实验站内（41°47′17″N， 111°53′46″E）， 该地区为中温带大陆性季风气候.海拔1 456 m，多年平均降水量为248 mm，其中6—9月份的降水量占全年总降水量的70%以上，年均蒸发量为2 947 mm，多年平均气温3.4℃.植被类型是以短花针茅（Stipa breviflora）为建群种的荒漠草原，伴生种有木地肤（Kochiaprostrata）、无芒隐子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida）等.

如文献[14]所述，于2006年5月在野外自然条件下开始增温和氮沉降的模拟实验.采用二因素完全随机区组裂区设计，设置12个3 m×4 m的实验区.为了避免干扰，实验区间设置了缓冲带（3 m×3 m）.随机对其中的6个实验区进行增温处理.对每个实验区的一半进行增氮处理，另一半不进行增氮处理，在增氮和不增氮处理间设有30 cm深的物理隔离.共计24个小区，即不增氮不增温（N0W0）、增氮不增温（N1W0）、不增氮增温（N0W1）和增氮增温（N1W1）4个处理，每个处理6次重复.在每个增温实验区的中央部位距地面2.25 m垂直高度处安装一台功率为2 kW的远红外线辐射器，不间断地进行加热以模拟增温处理.为降低误差，在不增温小区距地面2.25 m处也安装1台铁皮制的与远红外线辐射器大小相同的“假灯”.采用每年6—7月份雨季人工施加NH4NO3的方式（每年每平方米施加10g）模拟增氮.对不增氮不增温（N0W0）、增氮不增温（N1W0）和增氮增温（N1W1）3个处理进行分析.

1.2 样品采集和处理

2012年8月，用直径5 cm的土钻在每个实验小区随机采集0～30 cm的土样，经充分混匀后将其均分为2份，用塑料封口袋密封，低温4℃下运回实验室.其中一份立即进行土壤含水量的测定，另一份置于-20℃冰箱中保存备用.

1.3 主要仪器和试剂

1.3.1 仪器

PCR扩增仪（TC-960F），瑞士Blue Marlin公司；凝胶成像系统（Gel Doc XR+），美国Bio-Rad公司；人工气候箱（PQX-250H），廊坊市中仪国科仪器仪表有限公司.

1.3.2 试剂

孟加拉红培养基、Taq Es DNA聚合酶、土壤DNA提取试剂盒和BBI染液，生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.4 土壤可培养细菌的分离培养

制备牛肉膏蛋白胨培养基对土壤细菌进行培养.取1 g经充分混匀的新鲜土壤样品于装有100 mL无菌水的锥形瓶中，150 r/min下震荡20 min.取此浓度的土壤混悬液进行梯度稀释，以平板培养的菌落数为30～300个为便于计数的浓度，确定土壤混悬液的最佳质量浓度为1×10-4g/mL.取200 μL土壤混悬液，用涂布器均匀涂布于平板（Φ=90 mm）上，同一样品分别设置3个重复，置28℃恒温培养箱中培养3～4 d.根据文献[15]，按照菌落特征经初步分类和编号后进行菌落计数.最后挑取不同菌种的代表性菌落进行分离与纯化.

1.5 土壤可培养细菌的分子鉴定

1.5.1 土壤可培养细菌的16S rRNA PCR扩增

用土壤DNA提取试剂盒提取可培养细菌菌落的DNA并进行PCR扩增，所用引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′） .PCR 扩增体系为 50 μL：10×Es Buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）各 4 μL，上、 下游引物各2 μL，Tap Es DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL， DNA 模板（10 ng/μL）1 μL， 用超纯水补足至50 μL.PCR反应程序：94℃预变性5 min后进行30次扩增循环，即94℃变性1 min、55℃退火45 s、72℃延伸45 s，72℃延伸10 min.扩增后的PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳时间为25 min.

1.5.2 土壤可培养细菌的分子鉴定

将电泳能够检测到条带的可培养细菌的16S rRNA扩增产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，所得序列在GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，下载高质量的序列进行后续分析.

1.6 数据统计

采用Excel和Sigmaplot12.5进行数据录入和图表处理.采用SPSS13.0进行单因素方差（One-WayANOVA）分析，利用Tukey HSD比较不同处理中可培养细菌的数量和多样性指数的差异.利用Bio-dap软件计算可培养细菌的多样性指数，包括物种丰富度指数（S）、香农-威纳物种多样性指数（H′）、均匀度指数（E）和相对丰度（Relative abundance），计算公式如下：

式中：Ni为每一个样点分离出的全部种属的数目.

式中：Pi为第i种个体数占样品总个体数N的比例，Pi=ni/N，ni是第i种的菌株数，N是所有个体数的和.

式中：Hmax=ln S；H′为实际观察的香农-威纳物种多样性指数；Hmax为最大的香农-威纳物种多样性指数；S为物种丰富度指数.

2 结果与分析

2.1 土壤可培养细菌的种属特征

从内蒙古短花针茅荒漠草原土壤中共分离获得14种细菌，根据可培养细菌菌落16S rRNA序列分析结果和细菌鉴定手册[15]，这些细菌分别隶属于厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门的γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），如表1所示.

表1 可培养细菌菌株16S rRNA基因序列与最相似菌株的相似性Tab.1 Similarity of 16S rRNA gene sequence between the isolated cultivable bacteria and their closest strains

分离到的14种细菌中，有8种隶属于厚壁菌门，代表性菌株编号分别为XJ2（芽孢杆菌，Bacillus sp.CRRI-93_SW Azo）、XJ11（类芽孢杆菌，Paenibacillus castaneae）、XJ19（Uncultured Trichococcussp.QRSYY9）、XJ21（葡萄球菌，Staphylococcus sp.AJAR-J1）、XJ35（梭菌，Clostridium sp.）、XJ40（芽孢杆菌，Bacillus subtilis strainCYBS-19）、XJ43（芽孢杆菌，Bacillus sp.KT15）和XJ44（芽孢杆菌，Bacillus sp.W30）.其中，XJ2、XJ40、XJ43和XJ44隶属于芽孢杆菌属（Bacillus），XJ11隶属于类芽胞杆菌属（Paenibacillus），XJ19隶属于Trichococcus属，XJ21隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），XJ35隶属于梭菌属（Clostridium）.XJ15（假单胞菌，Pseudomonas sp.R-45822）隶属于γ-变形菌纲假单胞菌属（Pseudomonas）.XJ5（金黄杆 菌 ，Chryseobacterium sp.）和 XJ9（金黄杆菌，Chryseobacterium sp.S63.04.P.COS.HB.H.Ulcer.D.M）隶属于拟杆菌门金黄杆菌属（Chryseobacterium），XJ13（Pontibacter sp.Al-Dhabi-10）隶属于拟杆菌门Pontibacter属.XJ10（棒形杆菌，Uncultured Clavibacter sp.）隶属于放线菌门Clavibacter属， XJ39（双歧杆菌，Uncultured Bifidobacterium sp.）隶属于放线菌门双歧杆菌属（Bifidobacterium）.除XJ39外，其他分离获得的代表性菌株与GenBank中序列最相似菌种的相似性均≥97%，XJ39可能是潜在的新种.

2.2 增氮和增温处理对土壤可培养细菌数量、群落组成和多样性的影响

不同处理下，短花针茅荒漠草原土壤可培养细菌的数量、群落组成和多样性如表2所示.

表2 不同处理中土壤可培养细菌的数量、群落组成及相对丰度Tab.2 Quantity，community composition and the relative abundance of the cultivable bacteria in different treatments

由表2可以看出，增氮不增温和不增氮不增温处理小区中的可培养细菌物种数均为12种.XJ2（厚壁菌门芽孢杆菌属）、XJ35（梭菌属）和 XJ15（γ-变形菌纲假单胞菌属）是不增氮不增温处理中的优势种，其相对丰度分别为14.03%、45.22%和15.50%.经增氮不增温处理后，XJ2、XJ35和XJ15的相对丰度没有发生显著变化（P＞0.05），分别为15.67%、39.12%和8.03%.与不增氮不增温处理相比，增氮不增温处理显著增加了XJ13（拟杆菌门Pontibacter属）的相对丰度（P＜0.05），由5.72%上升到8.77%.另外，经增氮不增温处理后，XJ11（厚壁菌门类芽孢杆菌属）和XJ44（芽孢杆菌属）出现，XJ39（放线菌门双歧杆菌属）和XJ43（厚壁菌门芽孢杆菌属）消失.

与不增温不增氮处理相比，增温增氮处理使XJ2和XJ35的相对丰度降低，XJ2的相对丰度由14.03%降至7.52%，XJ35的相对丰度由45.22%降至26.78%，差异具有统计学意义（P＜0.05）.XJ15和XJ40（厚壁菌门芽孢杆菌属）的相对丰度均显著升高（P＜0.05），XJ15的相对丰度由不增氮不增温处理的15.50%升高到增氮增温处理的41.02%，并且成为增氮增温处理中的优势种，XJ40的相对丰度由不增氮不增温处理中的0.51%升高到增氮增温处理的8.17%.另外，XJ21（厚壁菌门葡萄球菌属）、XJ39、XJ43在增氮增温处理中消失.总的来看，增氮不增温处理和增氮增温处理使土壤中可培养细菌的总数增加，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）.

不同处理下短花针茅荒漠草原土壤可培养细菌的多样性如图1所示.由图1可以看出，增氮不增温降低了可培养细菌的物种丰富度指数（S），但差异不具有统计学意义（P＞0.05）.增氮不增温和增氮增温处理对可培养细菌的香农-威纳物种多样性指数（H′）、均匀度指数（E）均没有产生显著影响（P＞0.05）.

图1 不同处理0～30 cm土层中可培养细菌的多样性Fig.1 Diversity of the cultivable bacteria in different treatments at 0-30 cm soil depth

3 讨论与结论

3.1 增氮不增温对土壤可培养细菌群落组成和多样性的影响

不同研究中增氮对土壤细菌数量的影响存在差异.Sarathchandra等[16]对多年生牧草草地的研究结果显示，增氮对细菌总数没有影响.施瑶等[17]在内蒙古典型草原连续6 a的氮磷添加实验结果表明，随着氮添加量的增加，土壤细菌PLFA生物标记数量表现出上升趋势.谭成玉[18]对东北羊草草原进行连续2 a的增温和增氮实验，结果显示，增氮使细菌数量增加了16%.本研究对内蒙古短花针茅荒漠草原的土壤细菌进行增氮增温处理，结果发现，增氮不增温处理增加了可培养细菌的数量，但是与不增氮不增温处理相比差异不具有统计学意义（P＞0.05）.Frey等[19]研究表明，长期增氮会造成土壤酸化，破坏其结构，进而影响微生物的生存.本实验区的增氮不增温处理对0～30 cm土壤的pH基本没有影响，所以推测增氮造成的土壤酸化和对结构的破坏可以忽略.Craine等[20]的微生物氮矿化假说认为，土壤微生物利用易分解的碳来降解有机物以获得氮，这一过程受氮的可利用性的限制.李元恒[21]的研究表明，增氮效应增加了实验区的地下净初级生产力.本研究中，增氮并未使土壤细菌数量显著增加，究竟是因为植物与土壤微生物对氮的可利用性存在竞争关系，还是因为氮的矿化，或者是二者的共同作用，这有待于进一步研究.

增氮对微生物群落结构和多样性的影响在不同研究中也存在分歧.刘昭霞[22]对添加氮后的稀树草丛土壤细菌的研究表明，增氮能够增加土壤细菌的多样性和丰富度.隋心等[23]对三江平原湿地土壤细菌的研究表明，氮添加能够增加土壤细菌的群落多样性.杨山等[24]对典型温带草原的氮添加实验表明，增氮对土壤细菌的丰富度指数、均匀度指数和香农-威纳多样性指数均没有显著影响.这可能与增氮的量、增氮持续的时间长度、研究方法及生态系统等有关.Zeng等[25]研究认为，增氮既能够直接影响微生物的多样性，还可以通过土壤pH值和植物群落的改变间接影响微生物的群落结构.本研究中，增氮不增温处理改变了可培养细菌的群落结构，但对于可培养细菌的总数、物种丰富度、均匀度和香农-威纳物种多样性指数均没有显著影响.

3.2 增氮增温对土壤细菌的影响

增温增氮对土壤微生物的影响也没有统一结论.Rinnan等[26]对苔原土壤微生物的研究表明，增温能抑制细菌生长.高金涛[27]对中亚热带杉林土壤微生物的研究发现，增温增氮同样会抑制细菌生长.谭成玉[18]对松嫩草原土壤微生物的研究发现，增温增氮能够使细菌数量增加11%.Shen等[28]连续5 a的增温增氮实验表明，增温增氮的交互作用对土壤微生物几乎没有影响.本研究中的增温增氮处理对短花针茅荒漠草原土壤细菌的数量和多样性也没有显著影响，但改变了土壤细菌的群落结构，厚壁菌门的XJ2和XJ35的相对丰度显著降低，变形菌门的XJ15和厚壁菌门的XJ40的相对丰度显著增加，尤其是XJ15成为土壤细菌中的优势种，这可能与生态系统、实验地的特异性、增温持续时间、增温幅度等有关.