组蛋白去乙酰化酶在口腔来源成体干细胞成骨向/成牙本向分化的研究进展

宋 词，陈 婷，吴补领

南方医科大学1口腔医学院；2南方医院，广东 广州 510515

表观遗传学包括了DNA甲基化修饰，组蛋白共价修饰，染色质重塑，基因沉默和RNA编辑等调控机制。现今，表观遗传学已成为一大研究热点[1]。在肿瘤治疗机理中，大量的抗癌药物是通过表观遗传调控达到肿瘤治疗的目的[2-5]。除此之外，细胞成骨能力相关表观遗传学的机制研究也开始逐渐被人们所重视[6]。在口腔医学领域，口腔来源的成体干细胞相关的表观遗传学研究，也逐渐被重视。并取得了部分成果。有研究阐述了牙髓细胞牙髓再生过程中，表观遗传学的调控[7]。然而，大量的深层的作用机制仍未被人们所了解。本文阐述了组蛋白去乙酰化酶调节细胞成骨的研究进展以及其在牙髓再生医学中的应用前景。

1 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的概念与分类

Taunton等[8]首次从体内分离并证实了第一个组蛋白去乙酰化酶家族成员HDAC1的存在，并且认为其与基因沉默相关。组蛋白去乙酰化酶是一类蛋白酶，对染色质的结构修饰起重要的调控作用，并影响基因的转录表达。染色质由核小体组成，核小体由DNA双链缠绕于组蛋白八聚体组成。组蛋白去乙酰化酶可以通过去除组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基结合的乙酰基团，从而使染色质的结构致密卷曲，抑制基因的表达[9]。组蛋白去乙酰化抑制剂可以通过抑制其作用使染色质结构松弛、特定区域的基因暴露，从而促进基因的表达。随着越来越多HDACs家族新成员的发现，根据结构，组蛋白去乙酰化酶可分为4大类[10-11]，Ⅰ类：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；Ⅱ 类 ：HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、HDAC9、HDAC10；Ⅲ类：沉默信息调节因子（SIRT）相关酶类；Ⅳ类：HDAC11。实验证明，组蛋白去乙酰化酶不仅仅是作用于组蛋白，也可以作用基因片段，以及非组蛋白蛋白质[12-13]。

2 HDACs与成骨间的关系

2.1 Ⅰ类HDACs

Ⅰ类HDAC家族依其结构与酵母Rpd3具有同源性被归为同一类，其中包括：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8。因此，此类酶具有相似的结构域，与基因、蛋白以及组蛋白有相似的结合位点。但由于其不同组蛋白去乙酰化酶的其余结构差异，对于调节成体干细胞成骨/成牙本质向分化又有一定的特异性。

2.1.1 HDAC1 HDAC1与成骨向分化相关，最初其对于细胞成骨向分化的作用于2006年发现[14]，人原代骨髓细胞在成骨过程中，HDAC的表达水平会总体下降，其中HDAC1的表达改变尤其明显。并且证实，HDAC1抑制后可促进成骨相关基因sterix、骨钙素、骨桥蛋白和碱性磷酸酶的表达。研究发现，在C3h10t1/2细胞系骨向分化的过程中，HDAC1通过抑制RUNX2从而抑制其骨向分化[15]。HDAC1对于成骨分化的影响，与MircoRNA相关。2015年，在诱导多能干细胞中发现通过过表达miR-449a抑制HDAC1，可促进RUNX2的产生，以促进iPs的骨向分化[16]。说明HDAC1的产生，可以通过miR-449a进行调节。在体外细胞实验中，大量文献证明HDAC1可调节细胞的骨向分化。部分的体内实验同样证明了HDAC1与成骨密切相关。有研究发现，在妇女怀孕和哺乳期间，母体钙会大量流失，从而导致母体骨量损失[17]。断奶后，母体骨的合成水平上升。实验表明，其机制是通过抑制HDAC1来促进RUNX2的转录活性从而促进母体骨的形成。实验证明，多发性骨髓瘤的患者成骨功能不全，从而导致此类患者易发生骨折[18]。其机制是因为Runx2的p1启动子被抑制，若抑制HDAC1的功能，可以激活Runx2的转录，从而促进成骨。

2.1.2 HDAC2 HDAC2的抑制不会直接引起骨细胞的终末分化。研究发现在人牙髓细胞中，抑制HDAC2后，骨钙素的水平也下降[19]。因此其实验团队认为，HDAC2会刺激未成熟的成骨细胞的产生，其机制尚不明确。

2.1.3 HDAC3 HDAC3对于细胞成骨/成牙本质向分化过程的调控可能通过两条途径：（1）抑制HDAC3可促进Runx2靶基因的表达，从而促进成骨/成牙本质向分化。有研究发现，HDAC3调控RUNX2介导的细胞基因的转录从而促进成骨向分化[12]。（2）HDAC3抑制导致H3组蛋白上H3k9和H3k14位点被去乙酰化，过表达成骨相关因子，从而促进骨向分化。有研究发现，在人牙周膜干细胞骨向分化时HDAC3作用于H3组蛋白，使H3k9和H3k14位点被去乙酰化，过表达成骨相关因子，从而促进骨向分化[13]。

2.1.4 HDAC8 HDAC8活性抑制可以促进细胞成骨向分化。有实验证明，在大鼠的骨髓间充质细胞中，抑制HDAC8的活性，增强组蛋白H3K9乙酰化水平从而促进成骨相关基因表达Runx2、Osterix、骨钙素、骨桥蛋白和碱性磷酸酶，进而促进成骨[20]。

因此，大量实验表明，Ⅰ类HDACs可通过与Runx2相互作用，从而影响Runx2靶基因的表达。或者，其直接去乙酰化H3组蛋白上的特定位点，导致成骨/成牙本质相关基因表达上调，以促进成骨/成牙本质向分化。可以推测，Ⅰ类HDACs具有相似的可与Runx2相结合的位点，从而影响细胞分化。

2.2 Ⅱ类HDACs

Ⅱ类HDAC家族依其结构与酵母Hda1具有同源性被归为同一类，其中包括：HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7和HDAC9。因此，此类酶也具有相似的结构域，与基因、蛋白以及组蛋白有相似的结合位点。但根据其催化区域的不同，又被分为两类：Ⅱa类具有一段催化区域，包括：HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9；Ⅱb类具有两段催化区域，包括：HDAC6和HDAC10。目前尚无HDAC9和HDAC10对于成体干细胞成骨/成牙本质向分化调节相关研究，未来或可成为一研究热点。而HDAC4、HDAC5、HDAC6和HDAC7相关研究也并未探明其机制。

2.2.1 HDAC4 HDAC4通过去乙酰化非组蛋白蛋白质以及成骨相关基因的启动子区域，如Smurf-1、骨钙素及Osx，从而影响细胞的矿化。研究表明，抑制HDAC4以抑制Runx2被降解，从而促进BMP2的产生[21-22]。与Ⅰ类HDACs的作用机制不同，HDAC4未直接与Runx2相结合，而是通过影响Smurf-1以调节Runx2的降解过程。有研究在成骨细胞中发现，HDAC4去乙酰化骨钙素，使骨钙素的结构稳定，从而促进细胞骨向分化[23]。实验表明，HDAC4作用于Osx的K307和K312位点，使其去乙酰化，从而使其结构趋于稳定，促进骨向分化[13]。同时，可以促进Osx与DNA的结合，并增强其转录活性。

2.2.2 HDAC5 抑制HDAC5可促进成骨细胞分化，但是HDAC5在口腔来源的成体干细胞中促进骨向分化作用的研究有限。无法直接证明在口腔来源的成体干细胞中HDAC4、5对于成骨分化的影响。研究发现，HDAC5可以负向调节体内和体外的骨硬化蛋白水平[24]。在小鼠的ocy454骨细胞细胞株中，HDAC5结合并抑制MEF2C（为SOST的一个关键的转录因子）的表达，从而促进矿化。

2.2.3 HDAC6 在众多与HDAC6相关的文献中，更多的是在肿瘤领域中的应用。由于HDAC6被认为是异常蛋白降解的关键因子，因此，研究者多集中在其肿瘤治疗用药方面。然而，也有研究表明HDAC6与Runx2的启动子可以结合以调节成骨向分化进程。有研究发现HDAC6特异性地和RUNX2的羧基末端相结合，从而使RUNX2从细胞质转移到染色质[25]。在分化成骨细胞和前成骨细胞的过程中，Runx2的p21启动子表达被HDAC6抑制，从而导致成骨细胞的早期分化启动子受到抑制。

2.2.4 HDAC7 HDAC7被认为可能是成骨时间以及成骨细胞成熟率的重要调节因子。有研究发现，在C2C12细胞系中，HDAC7和RUNX2结合并抑制RUNX2的活性[26]。并且用RNA抑制剂沉默HDAC7后，会加速依赖BMP2的成骨分化过程。

2.3 Ⅲ类和Ⅳ类HDACs

目前为止，Ⅲ类HDACs与骨向分化的关系之间的研究较少，大多部分研究着眼于SIRT。有研究认为，SIRT通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（重要的脂向分化调控因子），从而抑制细胞的脂向分化，间接促进细胞的骨向分化[27]。研究证明，SIRT是牙周膜细胞分化的重要调节因子，抑制SIRT可以促进牙周膜细胞的分化[28]。实验证实，在小鼠胚胎干细胞中，胰岛素和SIRT1共同作用于细胞，可以增加其成骨分化效率[29-30]。Ⅳ类HDACs，HDAC11组蛋白去乙酰化酶家族中作用最为特殊的一个，其作用被认为更多的是与染色质的结构以及定位相关，其在骨向分化过程中的作用不明。

3 HDACi对于细胞成骨/成牙本质向分化的作用

HADC的抑制大多是通过HDACi实现的，然而，大部分的HDACi并不会特异性地抑制某一种HADC，而是抑制某一类或几类的HDACs。因此，不同的HDACi具有其特殊的作用。HDACi已在临床中作为抗肿瘤的药物广泛应用。在牙源性的成体干细胞中，HDACi也可作为药物直接使用。有研究认为组蛋白去乙酰化酶抑制剂和DNA甲基化抑制剂可作用于牙髓细胞并可应用于未来牙髓再生治疗[31-32]。

3.1 TSA（HDACⅠ、Ⅱ、Ⅳ类抑制剂）的成骨作用

TSA可以促进细胞的成骨向分化。研究表明，TSA促进MC3T3-E1细胞产生碱性磷酸酶，加速基质矿化和成骨细胞的基因表达[33]。有研究发现，在骨髓间充质细胞中TSA可增强BMP9诱导的早期成骨标志物碱性磷酸酶活性，以及成骨标志物骨桥蛋白、骨钙素和基质的矿化，证明HDAC抑制剂可以促进骨向分化[34]。骨髓间充质细胞是间充质来源的一类成体干细胞，口腔来源的成体干细胞也来源于间充质。因此，两者具有某些相同的生物学特性。实验证明，TSA促进人牙髓干细胞成牙本质向分化并会加强其增殖能力，在体外具有增强牙齿发育过程中牙本质形成和体内成牙本质细胞向分化的能力[35]。此外，TSA注射于胚胎表现出牙本质厚度增加以在免疫组化染色可见出生后磨牙牙本质细胞中，牙本质涎蛋白表达染色增强。有研究发现，TSA会促进人牙周膜干细胞的骨向分化，同时不影响细胞的存活以及活性。其实验同时说明，在人牙周膜细胞的骨向分化过程中组蛋白H3的乙酰化水平增加，而HDACi作用于H3以促进骨向分化。这一实验结果提供了牙周膜细胞作为种子细胞可被TSA刺激促进成骨，应用于牙再生治疗的可能性。

3.2 SAHA（HDAC1和HDAC3的抑制剂）骨向分化的作用

SAHA同样可以促进细胞成骨/成牙本质向分化。有研究发现，在C2C12细胞系以及HEK-293T细胞系骨向分化过程中，SAHA通过去乙酰化Runx2使其结构更稳定，从而增加Runx2的转录活性，并通过BMP-2来增强碱性磷酸酶的活性[21]。有实验证明了短期、低剂量的在成骨诱导过程中加入SAHA可以通过调节基质金属蛋白酶通路以及组织蛋白酶来促进牙髓干细胞的骨向分化[36-37]。SAHA可以促进基质金属蛋白酶的表达，进一步促进矿化相关标记物的产生。

3.3 VPA（HDACs抑制剂）骨向分化的作用

低浓度VPA不影响细胞活力，同时可以促进细胞分化。有研究观察到，在小鼠骨髓间充质细胞中VPA会促进细胞的成骨分化[38]。有学者发现，在人牙髓干细胞中，低浓度的VPA不影响细胞活力，增殖和细胞周期的分布[19]。同时，可以显著增强基质矿化水平，并促进骨桥蛋白和骨涎蛋白的表达。

4 结论

HDACs在牙再生组织工程学中的应用前景。对牙齿发生发育和口腔疾病发生发展，具有重大的影响。在发现HADC后的20年里，大量的研究关注热点在抗肿瘤的药物应用之中。近几年，HDAC对于细胞分化的调节作用以及其抑制剂对于促进组织再生的作用才开始受到重视。大量的研究结果表明HDAC具有应用于口腔再生医学的巨大潜力。