胃癌相关LncRNA Gas5/miRNA信号通路的研究进展

肖 杨，张金辉，方 法

南方医科大学深圳医院普通外科，广东 深圳 518000

胃癌是发病率较高的恶性肿瘤之一，是导致癌症死亡的第二大原因[1-2]。早期胃癌根治性切除显著提高了患者5年生存率及总生存率，而进展期胃癌术后5年生存率仍低于30%[3]，低诊断率使我国大部分患者为进展期胃癌，因此靶向治疗成为胃癌研究领域的热点，但目前尚无疗效稳定可靠的靶向药物用于进展期胃癌的长期治疗。

证据显示包括微小RNA（microRNA）及长链非编码RNA （LncRNA）在内的多种非编码RNA（ncRNA）对细胞的生理及病理过程具有重要影响[4-5]。研究发现，LncRNA与miRNA的失调控表达与胃癌的发生发展密切相关[6]。Gas5是一种常见的LncRNA，近年来研究表明Gas5在胃癌等多种肿瘤组织中呈低表达[7]，而Gas5在GC细胞中对miRNA的调控机制尚不明确。因此，探索Gas5-miRNA信号轴分子机制，对胃癌早期诊断、进展期胃癌的治疗具有深远意义。

1 胃癌相关LncRNA研究进展

在过去10年中，胃癌相关LncRNA的研究取得显著进展[8]。LncRNA参与多种肿瘤信号通路，如Notch、mTOR、NF-κb和Wnt[9-10]。它们控制细胞的增殖、迁移、凋亡、侵袭、致瘤性、细胞周期和转移。此外有大量证据表明，LncRNAs的异常表达在胃癌的诊断中具有重要的临床意义[11-21]，它们与胃癌的转移、浸润、TNM分期、预后、肿瘤大小和分化程度等临床病理因素有关，其中以转移和浸润最多（分别为61.70%和53.19%）。这些胃癌相关的LncRNAs可作为胃癌转移的生物标志物，从而有助于胃癌的临床诊断与治疗。

2 LncRNA生长特异抑制物5（Gas5）

Gas5也是近年来发现的具有肿瘤抑制功能的lncRNA[22]。Gas5最初是由于在生长抑制的鼠NIH3T3纤维原细胞中呈高表达而被发现的。在人体内，它定位于非编码蛋白染色体1q25.1的小开放阅读框[23]，全长630 nt[24]。Gas5与糖皮质激素应答元件竞争性结合糖皮质激素受体, 从而抑制了凋亡相关基因的表达[25]。已有研究发现，LncRNAGas5在多种肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等组织中呈低表达[26]，而该基因在胃癌中的表达及作用报道较少。

2.1 LncRNA Gas5/miRNA轴与其他肿瘤

2.1.1 子宫内膜癌 有研究通过qRT-PCR检测发现，过表达lncRNA-GAS5可明显抑制HEC-1A细胞内miR-21的表达水平[27]，在多种肿瘤中都证实PTEN基因是miR-21的下游抑制靶点之一。PTEN基因属于PTP基因家族成员，作为一种磷酸酶，PTEN的双重特异性磷酸酶特性能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化，由于许多癌基因的产物都是通过磷酸化而刺激细胞生长，因而具有巨大的抑癌潜能。由此证实，lncRNA-GAS5的抗子宫内膜癌细侵袭作用可能是通过抑制miR-21的表达和功能来实现的。通过进一步研究发现，在过表达lncRNA-GAS5后HEC-1A细胞内的表达水平也有所提高。至此，该研究初步探明了lncRNA-GAS5的作用机制是通过抑制miR-21/PTEN轴而实现的。

2.1.2 宫颈癌 有研究用基于Web的预测系统验证了Gas5与miR-196 A或miR-205之间存在结合区，以验证Gas5是否能直接与miR-196 A和miR-205相互作用[28]；同时构建了含有miR-196A或miR-205中Gas5野生型或突变型结合位点的荧光素酶载体，并进行了荧光素酶报告分析：miR-196A或miR-205过表达显著降低pmirGLO-Gas5报告子的荧光素酶活性，但对其空载体（pmirGLO）和突变型GLO-Gas5-mu1/2报告子无明显影响。已有文献表明miRNA通过含有RNA诱导沉默复合（RISC）关键成分Ago 2的miRNA核蛋白复合物（MiRNPs）发挥其功能[29]。为探讨Gas5与RISC复合物的物理作用及其与miR-196A和miR-205的相关性，该实验采用抗Ago2蛋白特异性抗体进行RIP检测，结果表明，miR-196a-或miR-205过表达SIHA和-ME-180细胞与对照组相比时，Ago2引起的内源性Gas5基因明显富集，提示miR-196 A和miR-205是Gas5靶向的miRNAs。再者，pcDNA-Gas5转染上调Gas5对SIHA和ME-180细胞miR-196 A和miR-205的表达有明显抑制作用，而GAS5-mut（1+2）对miR-196 A和miR-205的表达无明显抑制作用。以往研究表明，miR-196A和miR-205分别通过靶向FOXO 120和PTEN21发挥致癌miRNAs的作用。为进一步探讨Gas5是否通过海绵miR-196A和miR-205分别调节FOXO 1和PTEN的表达，该研究采用westernblot方法检测转染miR-196A、miR-205或pcDNA-Gas5联合转染的SIHA细胞中FOXO 1和PTEN的蛋白水平，结果显示，miR-196的异位表达降低了FOXO 1的水平，而miR-205的上调降低了SIHA细胞中PTEN的表达，而Gas5的过度表达则明显地消除了这些效应。以上结果表明Gas5在宫颈癌中具有miR-196A和miR-205分子海绵的功能。

2.1.3 食管癌 有研究将食管癌细胞与正常食管上皮细胞Het-1A相比，食管癌细胞系Gas5表达下调，miR-196 A表达上调[30]；同时，设计了一组探针来降低Gas5及其结合RNA，Gas5的偶数探针和奇数探针都能检索到LncRNA Gas5，通过Chirp-RT-qPCR，研究发现miR-196A能与Gas5结合。为了进一步确定miR-196A是否能与Gas5的第7外显子结合，该实验构建了2个包含Gas5外显子7或突变外显子7的报告载体，分别命名为Gas5-WT和Gas5-MU，将这2个载体与miR-196A模拟物或其抑制剂一起转染EC 109细胞。与正常细胞相比，miR-196A模拟物荧光素酶活性显著降低，而miR-196A抑制剂显著提了荧光素酶的活性。miRNAs通过RISC复合物与靶基因的3个主要非翻译区（UTR）结合来调控基因的表达。因此，使用抗AGO 2的抗体进行RNA免疫共沉淀，AGO 2是RISC复合物的关键组成部分。结果显示，在AGO 2颗粒中可检测到Gas5，并发现Gas5有超过20倍的富集（AGO 2抗体与IgG）；用miRNA抑制剂阻断miR-196A，并对AGO 2进行RIP实验，结果表明Gas5的富集显著降低。这些结果表明miR-196A可以通过RISC复合物调控Gas5的表达，近而影响食管癌的发生发展。

2.1.4 胰腺癌 研究检测了Gas5和miR-181c-5p在胰腺癌细胞中的表达，包括敏感细胞和耐药细胞，并在体外和体内利用功能增益和功能丧失的方法鉴定了Gas5和miR-181c-5p在胰腺癌细胞中的作用[31]，结果发现在耐药胰腺癌细胞中Gas5下调，miR-181c-5p上调，Gas5上调与肿瘤大小相关，Gas5过表达明显抑制细胞活力，而Gas5基因敲除则显示出相反的结果。此外，Gas5负调控的miR-181c-5p和miR-181c-5p通过阻断Hippo信号而显著促进胰腺癌细胞的化学抵抗，并且Gas5通过miR-181c-5p/Hippo调节胰腺癌细胞的耐药和Hippo通路。该实验证明Gas5负调控的miR-181c-5p和miR-181c-5p通过阻断Hippo信号而显著促进胰腺癌细胞的化学抵抗，从而证实Gas5通过miR-181c-5p/Hippo调节胰腺癌细胞的耐药和Hippo通路。

2.1.5 前列腺癌 有研究共收集118对前列腺癌组织和与之相匹配的癌旁非肿瘤组织，采用RT-PCR和原位杂交技术测定了LncRNA GAS 5暴露水平[32]；采用双荧光素酶报告法验证了IncRNA Gas5对miR-103的靶向作用；采用蛋白质激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素（MTOR）轴相关蛋白的暴露水平，包括AKT、mTOR和S6K1；采用免疫印迹法检测模拟LncRNA Gas5感染的PC3细胞、LncRNAGAS5 siRNA、LncRNA与miR-103的联合作用；采用MTT法、创面愈合法和Transwell Said法检测PC3细胞在感染后的增殖、侵袭和迁移能力；采用裸鼠移植瘤模型，在体内检测LncRNA Gas5对前列腺肿瘤生长的影响。结果显示，前列腺癌组织和细胞株LncRNA Gas5水平显著降低；低浓度LncRNA GAS 5可引起PC3细胞AKT/mTOR信号通路的激活。另外，过量暴露的LncRNA GAS 5通过阻断AKT/mTOR信号通路，在体外显著减缓前列腺癌细胞的生长和体内肿瘤的生长。该研究证明了LncRNA Gas5通过靶向miR-103介导AKT/mTOR信号通路，在前列腺癌发展减速过程中起重要作用。

2.2 LncRNA Gas5 与胃癌

有研究利用qRT-PCR检测89例胃癌组织标本，与癌旁正常组织相比，Gas5在胃癌组织标本中明显下降，并与肿瘤的分期和大小有关[33]。Kaplan-Meier分析和Long-rank试验得到低水平GAS 5患者有着较短的无疾病进展期和OS。COX回归分析表明，GAS 5降低是本病的独立预后指标。此外，GAS 5的异位表达在体外和体内均能抑制胃癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡，而内源性Gas5的表达下调则能促进细胞的增殖。研究发现Gas5可能通过调节E2F1和P21的表达而影响胃癌细胞的增殖。研究采用荧光定量PCR法，测定结果显示[34]：（1）胃癌组织中GAS 5的表达量明显低于正常胃粘膜组织，GAS 5的表达与胃癌组织的大小及胃癌的临床分期呈负相关；（2）人胃粘膜细胞系GES-1，人胃癌细胞系AGS和BGC-823中GAS 5的表达量低于人胃粘膜细胞系GES-1。胃癌细胞AGS中过表达GAS 5显著抑制了AGS细胞的增殖，而胃癌细胞AGS中低表达GAS 5促进了MGC-803细胞的增殖；（3）降低MGC-803细胞中GAS 5的表达，导致G0/G1期的细胞比例降低和S及G2/M期的细胞比例升高。相反，与转染空质粒的AGS细胞相比，过表达GAS 5的AGS细胞中G0/G1期细胞的分布显著增加，而S期细胞的比例显著降低；（4）GAS 5的过表达显著提升了AGS细胞中P21蛋白的表达水平，并抑制了CDK6蛋白的表达水平。MGC-803细胞中GAS 5的表达沉默抑制了P21蛋白的表达，而增强了CDK6蛋白的表达。下调CDK6的表达能显著抑制GAS 5/siRNA诱导的MGC-803细胞增殖。有研究发现LncRNA Gas5在胃癌组织中的表达与正常人成对相比表达下调，LncRNA Gas5与转录激活剂YBX 1相互作用，LncRNA Gas5表达下调促进YBX 1蛋白的周转，从而降低细胞周期调节因子p21的表达，并在G1期终止细胞周期阻滞[35]。文献检索与胃癌相关的LncRNA, 总结得出[36]：除调节p53外，胃癌LncRNA的抑癌活性还可通过调控视网膜母细胞瘤（Rb）通路上Gas5的表达进一步显示。Gas5是胃癌中下调的LncRNAs之一。E2F1和CyclinD1是Rb通路中的两个关键参与因子，通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。Gas5抑制E2F1和CyclinD 1蛋白水平，提高P21蛋白水平。这些研究结果为进一步了解LncRNA gas 5抑制胃癌的发病机制提供了新的思路，并对基于LncRNA的胃癌治疗方法的发展具有一定的指导意义。

3 LncRNA-miRNA信号轴与胃癌调控机制

目前研究已证实胃癌的发生发展通常与转录异常有关，这种异常不限于蛋白编码RNA（mRNA）水平的异常，也包括基因组中ncRNA调控能力的异常，包含lncRNA、假基因、miRNA等[37]，大量研究发现miRNA异常表达可通过序列互补与靶基因 3'端非编码区域（3'UTRs）的miRNA反应原件（MREs）结合，使其降解或抑制其翻译，近而抑制靶基因的表达[38]。同时，细胞内有一类内源性RNA，它们的 3'UTRs包含相同的MREs，可以通过MREs竞争性结合相同的miRNAs，调节各自的表达水平[39]，发挥转录后调控作用，调节肿瘤进程，称之为竞争性内源RNA（ceRNA）。随着ceRNA概念的提出，为研究胃癌等肿瘤的发生机制以及治疗肿瘤的手段提供了新方向。

3.1 LncRNA与miRNA在胃癌中的作用机制

LncRNA调控miRNA的作用机制主要有3个：（1）lncRNA能与miRNA竞争性结合靶基因mRNA的3'-UTR，从而对miRNA的负向调控机制进行抑制；（2）有些lncRNA是miRNA的前体，通过细胞核中的Drosha裂解、细胞质中Dicer切割，产生成熟的miRNA，调控靶基因的表达而发挥功能；（3）部分lncRNA能发挥内源性“miRNA海绵”的功能，与mRNA竞争性结合miRNA的MREs，进而达到抑制miRNA表达及其对靶基因的负向调控，即ceRNA机制[40]。

研究发现，LncRNA作为ceRNA调控mRNA的表达与胃癌的肿瘤体积、浸润深度、淋巴转移、病理等级、临床分期有着密不可分的关系，可作为潜在的生物靶点。最近，关于LncRNA Gas5的研究有望成为研究ceRNA调控机制的突破点。

3.2 LncRNA Gas5/miRNA-222信号轴

有研究探讨了Gas5、miR-222和PTEN/Akt/mTOR通路在GC细胞中的相关性[41]。采用Westernblot方法检测转染Gas5、miR-222或配对对照的SGC-7901细胞中PTEN的蛋白水平及Akt和mTOR的磷酸化水平，以及转染Si-Gas5、抗-miR-222或相应的诱导剂的MGC-803细胞的PTEN和mTOR磷酸化水平。结果发现，GAS 5恢复表达的SGC-7901细胞在PTEN水平上有促进作用，在p-Akt和p-mTOR中有抑制作用，而GAS 5基因敲除的MGC-803细胞对PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的影响相反；与miR-NC组相比，强制表达miR-222可使SGC-7901细胞的PTEN水平降低，p-Akt和p-mTOR水平升高，但不增加Akt和mTOR的总量；相反，miR-222能提高MGC-803细胞的PTEN水平，降低Akt和mTOR的磷酸化。以上结果表明Gas5过表达和miR-222抑制调控PTEN/Akt/mTOR通路。

通过分析pTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR在SGC-7901细胞中与Gas5、miR-222和MGC-803细胞共转染的si-Gas5和抗-miR-222共转染细胞中PTEN、p-Akt、p-mTOR和mTOR的蛋白水平，发现与载体相比，Gas5转染的SGC-7901细胞PTEN蛋白水平升高，Akt和mTOR磷酸化降低，而Gas5对SGC-7901细胞PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的影响被逆转。加注Gas5基因敲除后，MGC-803细胞的PTEN蛋白水平降低，p-Akt和p-mTOR蛋白水平升高，而Gas5基因敲除和miR-222抑制则部分逆转。由于抑癌基因PTEN对PI3K/Akt/mTOR通路负调控，而PI3K/Akt/mTOR通路是一种典型的生存途径，对细胞的增殖、生长和存活起着至关重要的作用，因此认为Gas5/miR-222轴通过PTEN/Akt/mTOR途径调控GC细胞的增殖。

3.3 LncRNA Gas5/miRNA-23a信号轴

有研究[42]通过qRT-PCR检测胃癌组织和癌旁非肿瘤组织中Gas5和miR-23a的表达，发现胃癌组织中Gas5水平低于癌旁非肿瘤组织；与癌旁非肿瘤组织相比，miR-23a在GC组织中的表达水平明显上调。相关分析显示Gas5与miR-23a在胃癌组织中的表达呈负相关。通过对胃癌细胞的功能损失率进行研究，发现Gas5过表达的GC细胞中miR-23a的表达水平明显降低；对Gas5的抑制增加了胃癌细胞miR-23a的表达。这些结果证实Gas5对胃癌细胞miR-23a表达具有负调控作用，提示Gas5可能通过与miR-23a的相互作用而成为miR-23a的抑制剂。在Gas5过表达的细胞中，MT2A mRNA表达明显上调，而GAS 5抑制细胞中MT2A mRNA的表达水平下降；此外，荧光素酶报告法表明Gas5过表达可抑制miR-23a诱导的MT2A 3‘UTR活性下降，而miR-23a高表达细胞中Gas5突变体的表达无明显变化。这表明Gas5可以通过海绵miR-23a调节胃癌细胞MT2A的表达。为进一步探讨MT2A与Gas5或miR-23a的相关性，采用qRT-PCR方法检测胃癌组织及癌旁非肿瘤组织中MT2A的表达。结果表明，与癌旁非肿瘤组织相比，胃癌组织中MT2A的表达水平明显降低；相关分析显示MT2A与miR-23a呈负相关，MT2A与Gas5呈正相关。这些数据支持Gas5作为miR-23a海绵在GC发病机制中的作用。Li等[43]同样也通过免疫印迹分析发现Gas5/miR-23a/ATG3轴可能是一种新的调控网络，有助于更好地理解自噬程序和细胞活力的调控。

4 结语

LncRNA作为ncRNA的重要组成部分，参与人体生理功能的调节，而近来研究发现Lnc Gas5作为一种常见的LncRNA参与乳腺癌、前列腺癌、肺癌等肿瘤的发生、发展的调控。随着ceRNA网络调控机制的提出，与肿瘤发生同样相关的miRNA作为复杂调控系统中必不可少的信号分子，并与LncRNA相互作用，这些研究同样为探索胃癌潜在的生物靶点开拓了新的道路。但目前Lnc Gas5通过调控miRNA影响胃癌发生发展的证据尚不充分，LncRNA/miRNA信号轴是否能作为胃癌诊断、预后的药物作用靶标还不明确，有待进一步深入研究。