鱿鱼及虾蟹加工下脚料发酵工艺研究

梁月钦，夏 磊，李 怡，闻正顺

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.舟山市农产品质量安全管理中心，浙江舟山 316021)

目前市面销售的菌种种类和数量与日俱增，许多研究都直接选取市售的微生物制剂进行试验。由于经过市场验证，市售菌一般都具有纯度高、活性好、成本低、无毒副作用、不污染生态环境等特点[1]，因而在各领域都具有广泛应用。生活垃圾资源化、土壤改良、病虫防害、污水处理等都有赖于微生物的作用[2-3]。

我国目前水产行业急速发展，但水产加工业的滞后导致了大量水产品废弃物的出现。尽管国际上试图通过各种废物处理系统减少废物，但每年产生的废物量一直在增加[4]。这些水产下脚料是重要的蛋白质和矿物质来源[5]，通过不同的方法例如微生物发酵水解，可以有效利用这些副产物。实际上，虾蟹的废弃物依然具有不可估量的商业价值[6]。例如，将小虾进行一定程度的深度加工可以制得价值数倍的人造对虾[7]。例如用鱿鱼内脏制备鱿鱼酱油，提取黑色素，生产钙制品等[8-10]，都是对废弃物的合理利用，是变废为宝的有效途径。本文以鱿鱼内脏、虾蟹下脚料为发酵基质，利用一种包含了光合菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌类的商业混合菌进行发酵技术和相应工艺的优化，为商业混合菌种合理利用水产品下脚料提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

商业菌：徐州益邦环保科技有限公司；

鱿鱼内脏、对虾下脚料、梭子蟹下脚料：舟山国际水产城；

碳酸钠、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠等均为分析纯，福林酚试剂（BR）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600 型紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅：金坛市亿能仪器实验厂；THZ-82B 气浴恒温震荡器：金坛区白塔金昌实验仪器厂；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DGG-9140A 型电热鼓风恒温干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；YC-260 L 4℃冰箱：上海启闵生物科技有限公司；FA1004N 分析天平：上海民桥精密科学仪器有限公司；TG20-WS 离心机：长沙湘锐离心机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵工艺

下脚料储存于-20℃冰箱中，通过流水解冻，称取2.0 g 下脚料，然后加入一定比例的无菌水，最后将商业菌液在无菌环境下接种到下脚料底物中进行单因素以及正交试验。发酵结束后离心取发酵上清液，利用福林酚法测定发酵液中可溶性蛋白的含量[11]，并计算出结果。

1.3.2 单因素试验设计

用预实验测定单因素水平范围。试验选取发酵温度、菌种接种量、料水比以及培养时间这4 个因素作为试验的单因素，根据发酵液中可溶性蛋白转化率来判断各因素对发酵效果的影响[11]。

1.3.3 正交试验设计通过前期单因素实验，选取上述4 种发酵因素来设计4 因素3 水平正交试验。正交试验设计如表1。

表1 正交试验设计Tab.1 Orthogonal experimental design

1.4 检测指标及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量测定

用Folin-酚法进行发酵结果的测定[12]。

1.4.2 可溶性蛋白转化率测定

可溶性蛋白转化率计算公式为：

式中M：蛋白转化率；Y：发酵前可溶性蛋白含量；X：发酵后可溶性蛋白含量；N：发酵原料总蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 商业菌发酵鱿鱼内脏试验结果

2.1.1 鱿鱼内脏单因素试验结果

2.1.1.1 料液比单因素试验结果

固定菌液接种量为25%，发酵温度为30℃，发酵时间为1 d，将料水比设为1:1、1:3、1:5、1:7、1:9。采用福林酚法测定发酵后蛋白转化率。实验结果如图1 所示。

微生物生长过程中水分具有维持生命体温、调节体液平衡等作用，而在发酵过程中添加适量的水，在为益生菌提供生长环境的同时也能够对其生命活动起到增益效果。从图1 可以看出，蛋白转化率随着水分添加量不断增加，料液比1:7 时达到最高，随后开始下降，可能是过多的水分导致底物被稀释从而影响了微生物代谢。

2.1.1.2 菌液接种量单因素试验结果

固定发酵温度为30℃，料水比为1:7，发酵时间为1 d，将菌液接种量设为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，发酵结束后测得发酵液中蛋白转化率含量，结果如图2 所示。

从图2 可以看出，菌液接种量在30%时发酵结果明显优于其它比例，而继续添加产物反而下降，可能是在一定的生长环境下过多的菌体发生了竞争生长，形成了一定的生物拮抗，从而影响了发酵水平。

2.1.1.3 温度单因素试验结果

固定菌液接种量为25%，料水比为1:7，发酵时间为1 d，将发酵温度设为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃进行发酵，结果如图3 所示。

图1 料水比对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.1 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

图2 菌液接种量对发酵液蛋白转化率的影响Fig.2 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

图3 发酵温度对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

每种微生物最适生长温度不尽相同，故而选择最适的发酵温度至关重要。从图3 可以看出，发酵温度在30℃时蛋白转化率明显高于其它温度，温度过低菌体生长缓慢，温度过高又会抑制菌体代谢活动，从而影响发酵结果。

2.1.1.4 时间单因素试验结果

固定菌液接种量为25%，料水比为1:7，发酵温度为30℃，将发酵时间设为1 d、2 d、3 d、4 d，考察发酵时间对发酵效果的影响。结果如图4 所示。

从图4 可以看出，发酵时间2 d 的发酵效果明显优于其它发酵条件。可能是发酵时间过久底物营养物质已不足以供给菌体生长，或是多肽又进一步被微生物水解形成小分子肽，难以被检测，从而导致检测结果降低。

2.1.2 发酵鱿鱼内脏工艺优化试验结果

2.1.2.1 正交试验设计及结果

根据表2 结果，由极差R 可得，影响蛋白转化率因素的主次为料液比＞温度＞接种量＞时间，即料水比是影响商业菌发酵鱿鱼内脏蛋白转化率最主要因素，这是由于鱿鱼内脏中营养成分丰富，且大多属于水溶性，合适的料液比可以更好地帮助菌体生长，从而提升发酵结果。鱿鱼内脏的最佳发酵条件为料水比1:7，温度35℃，接种量30%，时间1 d，此条件下，蛋白转化率可达20.33%。

图4 培养时间对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.4 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

表2 鱿鱼内脏正交试验设计与结果Tab.2 Orthogonal experimental design and results of fermented salmon guts

2.2 商业菌发酵虾下脚料试验结果

2.2.1 虾下脚料单因素试验结果

2.2.1.1 料水比单因素试验结果

条件同2.1.1.1，实验结果如图5 所示。

从图5 可以看出，蛋白转化率在料液比为1:7 时有最大值，再添加水反而稀释了底物营养，导致发酵水平下降。

2.2.1.2 菌液接种量单因素试验结果

条件同2.1.1.2，结果如图6 所示。

从图6 可以看出，蛋白转化率随着菌液接种量的增加不断提高，当接种量为30%时发酵效果最好，再多的菌液反而导致竞争生长，影响发酵效果。

2.2.1.3 温度单因素试验结果

条件同2.1.1.3，结果如图7 所示。

从图7 可以看出，发酵温度在30℃时候有蛋白转化率最大值，此时菌体协同效果最好，生长代谢最强，从而能够快速分解底物中的蛋白质。

2.2.1.4 时间单因素试验结果

条件同2.1.1.4，结果如图8 所示。

从图8 可以看出，发酵时间3 d 时蛋白转化率最高，此时对虾营养基本被消耗完毕，继续发酵反而导致可溶多肽进一步被分解。

图5 料水比对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.5 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

图6 菌液接种量对发酵液蛋白转化率的影响Fig.6 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

图7 发酵温度对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

图8 培养时间对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.8 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.2.2 发酵虾下脚料工艺优化试验结果

2.2.2.1 正交试验设计及结果

根据表3 结果，由极差R 可得，影响蛋白转化率因素的主次为料水比＞时间＞接种量＞温度，即料水比是影响商业菌发酵虾下脚料蛋白转化率最主要的因素，最佳发酵条件为料水比1:7，接种量30%，温度30℃，时间1 d，此条件下蛋白转化率达到13.18%。

表3 虾正交试验设计与结果Tab.3 Orthogonal experimental design and results of fermented shrimp

2.3 商业菌发酵蟹下脚料试验结果

2.3.1 蟹下脚料单因素试验结果

2.3.1.1 料水比单因素试验结果

条件同2.1.1.1，实验结果如图9 所示。

从图9 可以看出，蛋白转化率随料液比增加而提高，在1:7 时达到最大值，继续添加水反而导致蛋白转化效率降低，影响最终发酵结果。

2.3.1.2 菌液接种量单因素试验结果

条件同2.1.1.2，结果如图10 所示。

从图10 可以看出，蛋白转化率随菌液接种量的增加而不断提高，当菌液接种量为30%发酵效果最好，继续添加菌液反而导致竞争生长，使最终发酵蛋白转化率下降。

图9 料水比对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.9 Effect of feed water ratio on protein conversion in fermentation broth

图10 菌液接种量对发酵液蛋白转化率的影响Fig.10 Effect of inoculum quantity of bacterial liquid on protein concentration in fermentation broth

2.3.1.3 温度单因素试验结果

条件同2.1.1.3，结果如图11 所示。

从图11 可以看出，发酵温度在30℃时候蛋白转化率最大，是菌体最适的生长温度，温度太高或太低都会对菌体生长产生一定的抑制，影响菌体代谢活动，从而使最终蛋白转化率相对较低。

2.3.1.4 时间单因素试验结果

条件同2.1.1.4，结果图12 所示。

从图12 中可以看出，发酵时间2 d 时底物基本消耗殆尽，此时蛋白转化率最高，继续发酵反而导致水溶多肽被进一步分解成小分子肽，影响检测结果。

图11 发酵温度对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.11 Effect of fermentation temperature on protein conversion in fermentation broth

图12 培养时间对发酵液中蛋白转化率的影响Fig.12 Effect of culture time on protein conversion in fermentation broth

2.3.2 发酵蟹下脚料工艺优化试验结果

2.3.2.1 正交试验设计及结果

根据表4 结果，由极差R 可得，影响蛋白转化率因素的主次为接种量＞时间＞料水比＞温度，即接种量是影响商业菌发酵蟹下脚料蛋白转化率最主要的因素，通过添加合适量的微生物能最大限度地发酵梭子蟹，最佳发酵条件为料水比1:7，接种量30%，温度35℃，时间1 d，此条件下蛋白转化率可达12.76%。

表4 蟹正交试验设计与结果Tab.4 Orthogonal experiment design and results of fermented crab

2.4 讨论

商业混合菌发酵鱿鱼内脏的蛋白转化率可达20.33%；发酵虾下脚料的蛋白转化率可达13.18%；发酵蟹下脚料的蛋白转化率可达12.76%。由结果可见，商业混合菌发酵鱿鱼的效果相对虾蟹较高，说明底物对微生物发酵影响较大。而蛋白约占虾蟹下脚料干重的1/5[13]，相较于单一菌种的发酵，商业菌对虾蟹下脚料的转化结果相对较高。这主要得力于各菌种的协同作用，特别是其中的某些高效菌种发挥主要作用。已有研究表明，按照一定比率混合动物蛋白和植物蛋白共同发酵，可以将植物中限制性氨基酸的相关影响降到最低，平衡产物中氨基酸含量，从而可以加工成极具营养价值的高效饲料[14]。特别是一些高蛋白的原料，含量虽高，却难以被吸收利用，通过微生物发酵，可以将其中的大分子物质转化成易于吸收的小分子物质。利用微生物处理下脚料不仅赋予了海产品副产物更大的商业价值，且防止了这些下脚料对环境产生的不良影响，与当前大力提倡的绿色发展理念相符[15]。

3 结论

通过一系列优化试验，明确了商业菌发酵鱿鱼内脏及虾蟹下脚料的最佳条件，包括发酵温度、料水比、菌液接种量、发酵时间。其中发酵鱿鱼内脏的蛋白转化率可达20.33%；发酵虾下脚料的蛋白转化率可达13.18%；发酵蟹下脚料的蛋白转化率可达12.76%。可见通过商业复合菌的发酵，可以有效转化水产下脚料中的蛋白质等大分子营养物质，极大提升了水产下脚料的营养价值和应用前景。其中鱿鱼转化率最高，对虾其次，梭子蟹最低，说明底物本身的营养成分会对微生物发酵过程产生一定影响，后续研究或者实际应用过程中可以通过添加外源性营养物质补全底物营养源，从而更好地促进微生物生长代谢，提升发酵效率。随着无抗时代的来临，微生物技术逐步得到相关行业重视。微生物技术与水产行业的深度融合必将促进水产行业的多元化发展。