有机废弃物发酵处理专用微生物菌种的开发

朱剑锋，祁姣姣，靳改改，曾凯斌，库静雅，高小菲，马泽诚，王计伟，胡文锋,*

（1.生物源生物技术股份有限公司，广东 深圳 518118；2.华南农业大学，广州 510642；3.安佑集团研究院微生物研究所，江苏 太仓 215400）

有机废弃物主要包括餐厨垃圾、畜禽粪便、植物残余物、动物尸体等，含有大量的营养物质，如果处理不当，极易腐烂变质，散发恶臭，传播细菌和病毒，破坏生态环境，造成污染[1-2]。利用微生物发酵将有机废物转化为廉价、营养丰富、更易吸收的蛋白质饲料，不仅能够提高资源的利用效率，而且对消除环境污染、改善生态环境都具有重要意义[1,3-4]。

目前市售有机废弃物发酵菌种，发酵时间长，对于纤维类含量高的原料如豆渣，多采用霉菌等丝状真菌进行固态发酵[5-7]。然而，霉菌繁殖时，会产生大量菌丝，使发酵物料固化，这不利于昆虫等饲喂。另外一些霉菌如用于豆渣发酵的白地霉，存在安全性争议[8]。本研究旨在采用乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、复合酶等，对有机废弃物进行发酵，以达到缩短其发酵时间、提高酸溶蛋白、还原糖等小分子营养物质含量，利于其储存，方便和安全饲喂的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂及菌种

10126U纤维素酶，山东泽生生物科技有限公司；餐厨余：由深圳市朗坤生物科技有限公司提供。豆渣：本试验所用的豆渣，是含水量约为73%的新鲜豆渣经烘干后，无菌条件下加入无菌水得到的，其含水量、物理特性等基本特性与其新鲜状态一致。试验所需菌种，均为市售商品化菌粉（布拉迪酵母，2.00×1010cfu·g-1；啤酒酵母，2.00×1010cfu ·g-1；植物乳杆菌，1.00×1011cfu· g-1；鼠李糖乳杆菌，1.00×1011cfu·g-1；干酪乳杆菌，1.00×1011cfu· g-1；地衣芽孢杆菌，1.00×1011cfu ·g-1；枯草芽孢杆菌，1.00×1011cfu·g-1；纳豆芽孢杆菌，1.00×1011cfu · g-1）。

1.1.2 主要仪器设备

YSQ-LS-SII全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；FE20 pH计，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；二合一臭味检测仪，深圳市沃赛特科技有限公司。K9840自动凯式定氮仪，上海还能实验仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 测定方法

水分测定参照GBT6435-2014，还原糖和总糖采用3,5-二硝基水杨酸法，粗蛋白质测定采用凯氏定氮法，具体操作和计算参照GB/T 6432—1994。粗脂肪测定参照GBT6433-2006，霉菌总数测定参照GBT13092-2006，NH4及H2S通过臭味检测仪自动测定，AS测定参照GB/T13079-2006，Pb测定参照GB/T13080-2004。

pH的测定：每次测pH前要先把仪器用校准液校准，每个样品取1 g试样加99 mL蒸馏水或自来水，静置15 min，测定pH，测完pH要把仪器的笔插入保护液中。

酸溶性蛋白含氮量测定方法：称取样品干样2.00 g，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液10 mL，混合均匀，静置5 min[9]。将溶液定量转移，4 000 r·min-1离心10 min后，取5 mL上清液放入凯氏烧瓶中，采用凯氏定氮法测定含氮量，具体操作和计算参照GB/T 6432—1994。

活菌计数：取相应的试样,加入带玻璃珠的10 mL的无菌水中，200 r·min-1振荡30 min，为待测试样液。采用十倍稀释法，取3个适宜稀释度，分别移取100µL于相应的固体培养基表面（酵母菌采用PDA培养基，乳酸菌采用MRS培养基；芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，采用LB培养基），用玻璃棒轻轻地将菌悬液均匀地涂抹于培养基表面。芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌于37℃恒温培养24 h，乳酸菌于30℃培养48 h，酵母菌于28℃培养24 h，取长有30～300个菌落的平板计数。试验重复3次，同时做空白对照。

1.2.2 菌种有效活菌数的检测

菌种有效活菌数的检测见1.2.1活菌计数方法。

1.2.3 菌种颉颃作用探究

分别称取适量菌粉加入无菌液体培养基中（酵母菌采用PDA培养基，乳酸菌采用MRS培养基，芽孢杆菌采用LB培养基），恒温培养0.5～1 h。将活化好的菌液，以“口”型划线于MRS琼脂平板上（经预试验判定，试验所用菌种均能在MRS固体培养基上生长），34℃恒温培养，观察。

1.2.4 菌种初筛试验设计

菌种初筛见表1。按表1中的剂量水平配置成相应的发酵专用菌粉。将新鲜餐厨余加入麦麸，调节其水分为55%，分别加入各菌粉，搅拌均匀，37℃发酵15 h，后转移到30℃的培养箱中继续发酵33 h。

另外，将上述菌粉加入少量无菌水中（含有玻璃珠），37℃，150 r·min-1活化2 h，和豆渣搅拌均匀进行发酵。发酵过程为37℃，发酵24 h，后转移到30℃的培养箱中继续发酵24 h。

发酵结束后，测定其pH、NH3、H2S。然后，将其置于65℃烘箱中烘至水分约10%，测定还原糖、酸溶蛋白含量。

表1 菌种初筛

1.2.5 菌种复合酶发酵试验设计

上述试验中有机废弃物中豆渣没有发酵起来，下面在投料中加入纤维素酶和木瓜蛋白酶，帮助分解豆渣中的纤维素，为酵母菌和乳酸菌提供更多的能量。采用正交表L32（49）设计试验，见表2。发酵过程同1.2.4。

表2 试验设计

1.2.6 发酵中试试验设计

采用麦麸分别调节餐厨余水分55%、豆渣水分60%，接入最优比例菌粉，豆渣的发酵过程为37℃，发酵24 h，后转移到30℃，的培养箱中继续发酵24 h。餐厨余发酵过程为37℃，发酵15 h，后转移到30℃的培养箱中继续发酵30 h。发酵结束后，测定pH、还原糖、酸溶蛋白、NH3、H2S及霉菌总数、芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌数和重金属（AS、Pb）含量等指标。

2 试验结果

2.1 有机废弃物理化指标检测

餐厨垃圾、豆渣等有机废弃物原料常规主要成分及含量检测结果见表3。

由表3可知，餐厨余和豆渣营养丰富，餐厨余粗蛋白质含量为37.03%、豆渣粗蛋白质含量16.44%；两者pH均＞5，同时，两者含有大量的水分。当温度适宜时，其会迅速滋生大量的病菌和臭味，严重污染环境，存在安全隐患。

2.2 菌种有效活菌数检测

菌种有效活菌数检测结果见表4。

2.3 菌种颉颃试验结果

菌种颉颃试验结果见表5。

由表5可知，植物乳杆菌对枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌均有微弱的颉颃作用，鼠李糖乳杆菌对纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均有颉颃作用。

表3 餐厨垃圾、豆渣等有机废弃物原料常规主要成分及含量

2.4 菌种初筛试验结果

餐厨余发酵菌种初筛见表6。

由表6可知，混合菌种发酵餐厨余试验中，没有酵母菌的组合，均会长霉。长霉的组合，其发酵结束后还原糖含量相对其他组均高。但是长霉后，原料结块，对于养殖是不利的。提高其还原糖的含量可以通过加入纤维素酶来达到目的。

豆渣发酵菌种初筛结果见表7。

表4 菌种有效活菌数 cfu·g-1

由表7可知，混合菌种发酵豆渣实验中，发酵结束后，各组pH均＞5.0，显示没有发酵成功，根本原因是豆渣原料中含有大量的纤维、小分子还原糖含量过低（0.3365%）。芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌不能良好生长。故可以通过外加酶来达到发酵的目的。

2.5 加酶复合菌发酵试验结果

加酶复合菌发酵餐厨余和豆渣结果见表8、9。

最优组合确定标准为，发酵结束后，各废弃物的 4.0≤pH≤4.5，NH3＜10 ppm、H2S＜3 ppm，无异味，并具有较高的还原糖和酸溶蛋白含量。依据此标准分析如下，由表8可知，综合考虑加酶复合菌发酵餐厨余结果，6号、9号、11号、12号、15号、16号、21号、22号、24号、25号、26号、27号、28号等组合，均为较优组合。9号、16号、21号、27号、28号为最优组合。由表9可知，综合考虑加酶复合菌发酵豆渣结果，1号、2号、19号、25号、27号、28号、30号、31号、32号等组合，均为较优组合。27号为最优组合。

表5 菌种颉颃试验结果

表6 餐厨余发酵菌种初筛

表7 豆渣发酵菌种初筛

表8 加酶复合菌发酵餐厨余

续表

表9 加酶复合菌发酵豆渣

综合上述分析，27号组合（即布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢杆菌0.03%、植物乳杆菌0.1%、纤维素酶200 U·g-1、纳豆芽孢杆菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳杆菌0.05%）为发酵有机废弃物最优组合发酵菌粉。

2.6 发酵中试产物指标测定

发酵餐厨常规主要成分及含量见表10。

由表10可知，餐厨余经发酵后，其还原糖含量14.42%、粗蛋白质含量30.41%、小肽含量34.16%；并含有芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金属均为检出。经过发酵后，其营养指标得到提高，安全得到保障。

发酵豆渣常规主要成分及含量见表11。

由表11可知，豆渣经发酵后其还原糖含量5.137%、粗蛋白质含量24.45%、小肽含量42.94%；并含有芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌。其致病菌，AS、Pb等重金属均未检出。经过发酵后，其营养指标得到提高，安全得到保障。

表10 发酵餐厨常规主要成分及含量

表11 发酵豆渣常规主要成分及含量

3 讨论与结论

试验表明，采用布拉迪酵母0.125%、枯草芽孢杆菌0.03%、植物乳杆菌0.1%、纳豆芽孢杆菌0.03%、啤酒酵母0.25%、干酪乳杆菌0.05%，纤维素酶200 U·g-1对有机废弃物进行处理，其具有发酵速度快、物料发酵结束后疏松、营养丰富、安全等优点。

混菌发酵是利用各菌之间的相互配合作用，提高发酵效益[10-11]。本试验选用纤维素酶制剂，可以在短时间内分解粗纤维，为芽孢杆菌的迅速繁殖提供基础能源。特别是在处理含有高粗纤维的原料时，纤维素酶的加入对于加速发酵进程具有更显著的意义[12-13]。芽孢杆菌分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多种酶系，从而全面启动混菌发酵。酵母菌属于兼性厌氧菌，生活在偏酸环境中，菌体蛋白含量高达50%～60%，发酵过程产生酒香味，可以改善适口性。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，同时产生细菌素、类细菌素等抑菌物质，有效抑制有害微生物的活动和有机物的急剧腐败分解[14]。可能正是经过以上酶菌的协同作用，使得该复合菌剂处理有机废弃物时，可达到高效、安全且产物营养丰富，更利于储存与食用等优点。该复合菌剂对处理有机废弃物具有积极的意义。