不同时间穴位贴敷对过敏性哮喘大鼠免疫指标的影响

金禹彤,吴凌韬,陈姗,宣丽华



不同时间穴位贴敷对过敏性哮喘大鼠免疫指标的影响

金禹彤1,吴凌韬1,陈姗1,宣丽华2

(1.浙江中医药大学,杭州 310053;2.浙江中医药大学附属第一医院,杭州 310006)

观察不同时间穴位贴敷对过敏性哮喘大鼠行为学及血清免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-g(IFN-g)水平的影响,探讨穴位贴敷治疗哮喘的作用机制。50只Wistar雄性大鼠按体重采用随机数字表法分为A组(正常对照组)、B组(哮喘模型组)、C组(地塞米松组)、D组(穴位贴敷2 h组)和E组(穴位贴敷4 h组)。以鸡卵白蛋白(OVA)制备大鼠哮喘模型,14 d后各组分别给予相应治疗。观察大鼠治疗前后引喘潜伏期和发作总持续时间变化;采用HE染色检测大鼠肺组织病理改变,ELISA法测血清中IgE、IL-4和IFN-g水平变化。与A组比较,B组引喘潜伏期显著缩短、发作持续时间显著延长(＜0.05);病理显示肺组织炎症明显;IgE、IL-4显著升高,IFN-g显著降低(＜0.05)。与B组比较,C组、D组、E组治疗后引喘潜伏期明显延长、哮喘发作持续时间明显缩短(＜0.05);肺病理组织观察显示穴位贴敷后支气管及肺实质炎性改变显著改善;血清中IgE和IL-4水平显著降低,IFN-g水平显著升高(＜0.05)。D组、E组各指标比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。穴位贴敷可以通过改善肺组织炎症,减低IgE、IL-4,升高IFN-g的表达来治疗哮喘,且不同贴敷时间对治疗效果无明显影响。

穴位贴敷法;哮喘;大鼠;IgE;IL-4;IFN-g

过敏性哮喘是一种由肥大细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等多种炎性细胞介导的Ⅰ型超敏反应性疾病,全球约有3亿哮喘患者,各国哮喘患病率1%～30%不等,中国约为0.5%～5%,且呈逐年上升趋势[1]。目前常用治疗方法为b2肾上腺素受体激动剂、茶碱类药物及小剂量糖皮质激素等,可局部抗炎且起效迅速,它虽然可以有效地控制哮喘发作,但长期应用可引起骨质疏松等不良反应[2]。穴位贴敷是传统的中医外治疗法,也是临床治疗过敏性哮喘的常用方法,且安全无不良反应。目前对于穴位贴敷治疗哮喘的研究多集中于不同穴位、不同药物对于疗效的影响[3-4],本实验从不同贴敷时间入手明确贴敷时间与疗效的关系,并从病理及免疫方面探讨其相关机制,为临床治疗选择适宜贴敷时间提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar雄性大鼠50只,体重160～200 g,6周龄,由浙江中医药大学动物中心提供,使用许可证号SYXK(浙)2013-0184,严格遵照“实验动物环境及设施GB14925-2001”,并遵守动物伦理和福利原则,方案通过学校实验动物伦理委员会批准。大鼠分笼饲养在湿度60%～70%、室温21～25℃环境中,12 h昼夜节律,适应性饲养1周后使用。

1.2 主要试剂和仪器

卵白蛋白OVA(美国Sigma公司,高纯,金标级);氢氧化铝凝胶(美国Sigma公司);地塞米松注射液(江西博莱大药厂有限公司);IgE、IL-4和IFN-g的ELISA试剂盒(杭州联科生物公司);超生雾化器;自制玻璃箱。穴位贴敷贴膏由中药白芥子、延胡索、细辛、甘遂、冰片按照1:1:0.5:0.5:0.1比例组成(浙江省中医院自制)。

1.3 大鼠哮喘模型制备

50只Wistar大鼠按随机数字表法分为5组,A组(正常对照组)、B组(哮喘模型组)、C组(地塞米松组)、D组(穴位贴敷2 h组)和E组(穴位贴敷4 h组),每组10只。除A组外各组参照改良Palmans方法[5]致敏建立哮喘模型。每只造模大鼠第1天和第8天皮下多点注射含10 mg OVA和100 mg Al(OH)3的1 mL生理盐水混悬液致敏,第15天开始放入透明玻璃箱内,用1%的OVA生理盐水溶液激发哮喘,每次30 min,隔日1次。直至第56天雾化结束。

最后一次雾化观察造模后大鼠,当其出现打喷嚏、腹式呼吸明显、四肢无力瘫软、鼻痒抓鼻、反应迟钝等症状视为激发成功,并将大鼠肺部做病理切片HE染色后进一步确定造模成功。

1.4 治疗方法

第56天所有造模结束后,大鼠正常饲养14 d,待其进入缓解期。第15天起分组治疗。A组、B组正常饲养;C组腹腔注射地塞米松,隔日1次,每次0.5 mg/kg;D组、E组大鼠背部剃毛,并在其双侧肺俞、脾俞、肾俞(定位参考《实验针灸学》[6])贴敷0.8 cm×0.8 cm的膏药,胶布固定,D组2 h后取下膏药,E组4 h后取下膏药,隔日1次,共7次。

1.5 观察指标

1.5.1 行为学观察

从雾化开始到大鼠出现喷嚏、抓鼻、腹式呼吸明显等表现的最短时长为引喘潜伏期,雾化期间出现这些表现的持续时间总和为发作总持续时间。造模第56天将所有大鼠用OVA生理盐水溶液雾化激发30 min,其间观察大鼠引喘潜伏期和发作总持续时间并记录。最后1次治疗结束后2 h再次将所有大鼠用OVA生理盐水溶液雾化激发30 min,观察并记录以上指标。

1.5.2 血清指标检测

治疗结束后12 h,取1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。各组大鼠心脏取血5 mL,静置2 h,以3000 r/min离心10 min,标号后取上清液,放置﹣70℃冰箱保存。ELISA法检测各组大鼠血清中免疫球蛋白E(IgE)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-g(IFN-g)水平,步骤严格遵循ELISA试剂盒说明。

1.5.3 肺组织病理检测

大鼠取血结束后脱颈处死,取右肺组织,用4℃生理盐水漂洗干净,置于10%中性甲醛中固定24 h[7],石蜡包埋、切片并HE染色,置于光学显微镜下观察肺组织病理改变情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多样本均数比较采用单因素方差分析(AVONA),均数间两两比较采用检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 穴位贴敷对哮喘大鼠引喘潜伏期与发作总持续时间影响

从表1可见,治疗前后B组在引喘潜伏期上短于A组,发作持续时间长于A组(＜0.05),说明哮喘模型造模成功;治疗前B组、C组、D组和E组引喘潜伏期和发作总持续时间比较,差异无统计学意义(＞0.05)。治疗后C组、D组、E组引喘潜伏期长于B组、发作持续时间短于B组,差异有统计学意义(＜0.05),说明地塞米松和穴位贴敷对过敏性哮喘治疗效果显著;治疗后D组和E组在引喘潜伏期和发作总持续时间上比较,差异无统计学意义(＞0.05)。

表1 各组大鼠治疗前后引喘潜伏期与发作总持续时间变化 (±s,s)

注:与A组比较1)＜0.05;与B组比较2)＜0.05

2.2 各组大鼠血清IgE、IL-4、IFN-g水平比较

与A组比较,B组大鼠血清中IgE、IL-4水平升高, IFN-g水平降低(＜0.05);与B组比较,C组、D组、E组大鼠血清中IgE、IL-4含量降低,IFN-g含量升高(＜0.05);D组和E组比较差异无统计学意义(＞0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清IgE、IL-4、IFN-g水平比较 (±s)

注:与A组比较1)＜0.05;与B组比较2)＜0.05

2.3 肺组织结构观察

HE染色的肺组织病理切片显示,A组肺实质无明显炎性改变,肺泡结构基本完整,肺泡周围有极少量炎性细胞浸润。B组肺组织结构不清,支气管壁黏膜水肿,肺泡内和肺泡间隔见明显炎性细胞浸润。C组、D组、E组肺组织结构相对清晰,肺泡内及周围黏膜水肿减少,肺组织炎症有所减轻,炎性细胞浸润减少。详见图1。

3 讨论

过敏性哮喘发病机制至今未完全明确,可能为多种机制引起的一种共同反应。大量临床及实验研究表明,其发生发展与免疫和变态反应、气道炎症、神经调节以及气道高反应密切相关[8]。

众所周知,过敏性哮喘属于Ⅰ型超敏反应中的一种,由IgE介导产生。有研究表明,哮喘的发生与患者接触过敏原后血清总IgE及过敏原特异性IgE的升高密切相关[9-10],变应原通过吸入等途径进入易感者体内,在巨噬细胞和淋巴细胞的协助下,由B淋巴细胞合成IgE抗体并进入致敏状态,当相同的过敏原再次进入机体,机体将启动免疫应答反应,结合细胞表面的IgE抗体,使肥大细胞及嗜酸粒细胞增多并脱颗粒,产生多种炎症因子,从而引起气道炎症反应激发哮喘。

图1 大鼠肺病理形态(HE,×200)

IL-4和IFN-g与IgE水平密切相关,在哮喘发病过程中起至关重要的作用。IL-4是由CD4﹢细胞分泌的一种活性细胞因子[8],主要功能为促进B细胞分化、增殖和活化,促使Th0细胞向Th2细胞转化,同时诱导IgG向IgE转化。1986年Coffman RL等[11]首先证实IL-4可诱导小鼠B细胞合成IgE,Kubo M[12]研究证实IL-4主要由Th2细胞介导释放,可以引起IgE水平的升高,产生过敏反应。IFN-g主要来源于CD8﹢细胞,可以通过抑制IL-4 mRNA转录水平拮抗IL-4,从而抑制体内IgE的产生。Ma L等[13]的证明,疫苗可通过升高IFN-g水平以降低血清IgE水平来治疗过敏性哮喘。Mitchell C等[14]发现IFN-g能明显抑制由IL-4诱导的B淋巴细胞增殖,减轻气道炎性反应,降低气道的阻塞程度。徐文中等[15]发现血清IgE、IL-4和IFN-g与患者的过敏性鼻炎发病有关。

穴位贴敷疗法在治疗哮喘方面有其独特的优势,其可温经通络,散寒止痛,调节人体阴阳平衡,并提高人体自身防病抗病的能力。临床及实验研究证明,穴位贴敷可以通过调节免疫、改善炎症等相关机制治疗过敏性哮喘[16-22]。陈晓勤等[23-24]研究发现“阳虚哮喘敷贴方”可以下调人体内的免疫球蛋白IgE的含量,从而缓解哮喘症状。高修安等[25]在涌泉穴贴敷海龙蠲哮方合咳喘平,证明其可以通过降低IgE、减少炎性细胞数量来缓解肺组织炎症,治疗儿童哮喘。

本实验结果表明,过敏性哮喘大鼠给予地塞米松及穴位贴敷治疗均可有效降低其血清IgE和IL-4浓度,升高IFN-g浓度,减少免疫反应及炎性细胞浸润,从而改善哮喘症状,为穴位贴敷治疗过敏性哮喘提供了理论和实验依据。

此外,实验观察显示,穴位贴敷4 h组大鼠的皮肤反应较穴位贴敷2 h严重,在临床中反应为患者皮肤发红,甚至有水泡、脓包等表现。但结果表明穴位贴敷2 h与穴位贴敷4 h组在治疗支气管哮喘方面均有明显的效果,且在行为学评价、病理观察及血清IgE、IL-4和IFN-g指标上两者之间的差异无统计学意义(＞0.05)。传统的穴位贴敷理念认为,将贴敷时间延长而使皮肤达到发红甚至起泡状态时疗效较好。但在临床治疗过程中,有部分患者对于由于贴敷时间过长而出现的皮肤水泡等情况难以接受,甚至因此而中断治疗。此研究结果显示,不同的贴敷时间对于哮喘治疗效果及血清中的免疫指标影响并不显著。因此,根据患者的具体情况选择适当的贴敷时间,进行多靶点小剂量的刺激,既可以保证患者治疗哮喘的疗效,同时又可以减轻患者痛苦,可用于指导临床。

[1] 葛均波,徐永健.内科学[M].北京:人民卫生出版社, 2013:28-33.

[2] Allen CS, Yeung JH, Vandermeer B,. Bisphospho- nates for steroid-induced osteoporosis[J]., 2016:CD001347.

[3] 韩东岳,刘畅,郄丽丽,等.基于数据挖掘技术的穴位贴敷治疗过敏性鼻炎的选穴与用药规律分析[J].中国针灸,2015,35(11):1177-1180.

[4] 林勇凯,梁桂洪,黄宇新,等.三伏贴敷疗法治疗不同证型过敏性鼻炎疗效观察[J].中国针灸,2014,34(10): 967-971.

[5] Palmans E, Kips JC, Pauwels RA. Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J]., 161(2 Pt 1):627- 635.

[6] 李忠仁.实验针灸学[M].北京:中国中医药出版社, 2007:1-307.

[7] Locke NR, Royce SG, Wainewright JS,. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease[J]., 2007,36(5):625-632.

[8] 李明华,殷凯生,蔡映云.哮喘病学[M].北京:人民卫生出版社,2005:111-128.

[9] Sun BQ, Chen DH, Zheng PY,. Allergy-related evidences in relation to serum IgE: data from the China state key laboratory of respiratory disease, 2008-2013[J]., 2014,27(7):495-505.

[10] Palomares Ó, Sánchez-Ramón S, Dávila I,. dIvergEnt: How IgE axis contributes to the continuum of allergic asthma and anti-IgE therapies[J]., 2017,18(6):E1328.

[11] Coffman RL, Ohara J, Bond MW,. B cell stimulatory factor-1 enhances the IgE response of lipopolysaccharide -activated B cells[J]., 1986,136(12):4538- 4541.

[12] Kubo M. T follicular helper and TH2 cells in allergic responses[J]., 2017,66(3):377-381.

[13] Ma L, Xiao X, Ma Y,. Effect of activation of Toll-like receptor 7 in the inhibition of allergic asthma on a mouse model[J]., 2017,9(5):2143- 2152.

[14] Mitchell C, Provost K, Niu N,. IFN-gacts on the airway epithelium to inhibit local and systemic pathology in allergic airway disease[J]., 2011,187(7): 3815-3820.

[15] 徐文中,刘春艳.过敏性鼻炎患儿淋巴细胞亚群、血清IgE水平的变化及其相关性[J].中国免疫学杂志, 2016,32(4):550-552.

[16] 周姗,刘兰英,王和生,等.咳喘停贴剂穴位贴敷对哮喘合并过敏性鼻炎患者血清IgE的影响[J].针灸临床杂志,2016,32(5):40-43.

[17] 陈静,邓桂珠,陈芳,等,三伏天与非三伏天穴位贴敷对变应性鼻炎患者生活质量影响的比较研究[J].中国针灸,2012,32(1):31-34.

[18] 陈劼,赖新生,唐纯志.穴位敷贴对过敏性鼻炎小鼠脾淋巴细胞特异性增殖的影响[J].广州中医药大学学报, 2011,28(3):243-245.

[19] 吕明辉,贾艳平,元国红.清热涤痰定喘汤联合穴位贴敷治疗儿童支气管哮喘安全性及疗效分析[J].陕西中医,2019,40(1):25-27.

[20] 白文梅,翟豫疆,伊敏努尔·吐尔逊.五虎汤联合穴位贴敷对支气管哮喘患者气道重塑及MMP-9因子的影响[J].世界中医药,2018,13(12):3134-3137,3141.

[21] 石文英,张容毓,罗容,等.三伏穴位贴敷与三伏针刺治疗支气管哮喘临床疗效对比及其免疫机制的研究[J].上海针灸杂志,2018,37(10):1121-1125.

[22] 梁志娟,耿立梅.穴位贴敷联合穴位注射乌体林斯对OVA哮喘模型大鼠气道炎症和气道高反应的影响[J].中国中医基础医学杂志,2018,24(9):1273-1275, 1321.

[23] 陈晓勤,许勇,倪伟,等.“阳虚哮喘敷贴方”穴位敷贴对支气管哮喘免疫机制的影响[J].中国中医急症, 2012,21(5):701-702,706.

[24] 徐君逸,陈晓勤,陈利清,等.阳虚哮喘敷贴方冬病夏治穴位敷贴治疗支气管哮喘疗效观察[J].临床合理用药杂志,2013,6(4):87.

[25] 高修安,朱锦善.海龙蠲哮方合咳喘平涌泉穴位贴敷治疗小儿支气管哮喘发作期临床观察[J].中国中西医结合杂志,2005,25(8):738-740.

Effect of Acupoint Application at Different Time Points on the Immune Indexes in Allergic Asthma Rats

-1,-1,1,-2.

1.,310053,; 2.,310006,

To observe the effect of acupoint application at different time points on the behaviors and levels of immunoglobulin E (IgE), interleukin (IL)-4 and interferon (IFN)-gin allergic asthma rats, and to discuss the mechanism of acupoint application in treating asthma.Based on the body weight, fifty male Wistar rats were divided by the random number table into group A (normal control group), group B (asthma model group), group C (dexamethasone group), group D (acupoint application 2 h group) and group E (acupoint application 4 h group). Asthma rat model was developed received corresponding intervention 14 d later. The attack latency and duration were observed before and after the intervention; HE staining was used to detect the pathological changes in lung tissues; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to examine the changes in serum levels of IgE, IL-4 and IFN-g.Compared with group A, the asthma attack latency was significantly shortened and the attack duration was significantly extended in group B (＜0.05); pathological analysis showed obvious pulmonary inflammation; the levels of IgE and IL-4 increased markedly and the level of IFN-gdecreased significantly (＜0.05). Compared with group B, the attack latency was significantly extended and the duration was markedly shortened in group C, D and E (＜0.05); pathological analysis revealed improved bronchial and pulmonary inflammation; the serum levels of IgE and IL-4 decreased significantly and the level of IFN-gincreased significantly (＜0.05). There were no significant differences in the indexes between group D and E (＞0.05).Acupoint application can treat asthma through improving pulmonary inflammation, down-regulating IgE and IL-4 and up-regulating IFN-g, and different application time does not have significant impact on the treatment result.

Acupoint sticking therapy; Asthma; Rats; IgE; IL-4; IFN-g

1005-0957(2019)03-0331-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.03.0331

2018-07-13

浙江省重大科技专项计划项目(2014C03046-2)

金禹彤(1991—),女,2016级博士生,Email:379757201@qq.com

宣丽华(1960—),女,教授,Email:xlh1083@163.com