UPLC-MS/MS法测定乳基食品中谷氨酰胺含量研究

文/王荣艳 徐聪玲 李海龙 任一平＊

（1 杭州立高检验检测技术研究院有限公司；2 贝因美婴童食品股份有限公司）

谷氨酰胺（glutamine，Gln）是组成蛋白质的重要氨基酸之一，是人体中大多数器官与组织所需的特殊营养物质，即基本营养素或条件性必需氨基酸。由于结构中多一个酰胺基，Gln成为体内氮的运载机体，对维护机体正常的蛋白质代谢起到重要作用。Gln能够调节有关细胞防御和修复、代谢、信号转导等基因的表达，激活细胞内信号转导通路，对细胞修复和免疫调节至关重要，在创伤、感染、肠功能障碍患者，危重症患者，新生儿等领域得到广泛应用。因其独特而复杂的生理功能，Gln逐渐成为营养学、生理学、营养免疫学等学科领域的研究热点[1，2]。服用Gln能够起到促进蛋白质合成，降低蛋白质分解，改善患者营养状况，促进创面愈合，缩短住院日等功效[3，4]，且作为特殊医学用途食品的添加成分，Gln能够更好地满足特定疾病状态或疾病某一阶段的营养需求。

表1 Gln和IS的质谱参数

目前，Gln添加量或者含量的测定方法主要是衍生后通过液相色谱仪或氨基酸分析仪测定，衍生过程较复杂，且易产生衍生不完全等现象。本文旨在建立一种易操作、高精准、快速的测定乳基为基础的特殊医学用配方食品中Gln的定量方法，样品处理不需要衍生即可进行超高效液相色谱质谱联用仪分析。

1 材料与方法

1．1 材料

Acquity UPLC XEVO TQ-XS三重四级杆串联质谱仪（Waters公司）；高速低温离心机（Sigma 3 K 1 5）；电子天平（奥豪斯AR223CN）。

谷氨酰胺对照品，C5H10N2O3，纯度≥99%（Dr. Ehrenstorfer Gmbh）；L-谷氨酰胺-2,3,3,4,4-d5对照品，C5H5D5N2O3，纯度≥98%（加拿大CDN公司）。

甲醇，色谱纯（R C I Labscan）；乙腈，色谱纯（RCI Labscan）；甲酸，色谱纯（ACS恩科）。

1．2 试验方法

1．2．1 溶液配制

Gln标准溶液：分别称取10 mg（精确至0.1 mg）谷氨酰胺对照品（简称Gln）和L-谷氨酰胺-2,3,3,4,4-d5对照品（简称IS）于10 mL容量瓶中，用超纯水配成浓度约为1 000 mg/L标准贮备液，4 ℃保存。然后分别用超纯水稀释成浓度为10 mg/L中间液和1 mg/L使用液。

0.1%甲酸甲醇：取0.1 mL甲酸于100 mL容量瓶中，甲醇定容至100 mL。

0.1%甲酸水：取0.5 mL甲酸于500 mL容量瓶中， 超纯水定容至500 mL。

0.1%甲酸乙腈：取0.5 mL甲酸于500 mL容量瓶中，乙腈定容至500 mL。

1．2．2 样品前处理

（1）样液制备

称取1 g（精确至0.01 g）粉状试样（或10 mL液体试样）于100 mL容量瓶中，加入IS中间液（10 mg/L）1.0 mL，并加入80 mL超纯水将试样溶解（或稀释），超声提取10 min，用超纯水定容至100 mL。取0.5 mL定容后的样液于5 mL离心管中，加入1.5 mL 0.1%甲酸甲醇，10 000 r/min低温离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

（2）空白试验

除不加试样外，其余处理同（1）。

1．2．3 Gln标准工作液制备

分别吸取Gln使用液（1 mg/L）0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，各加入IS中间液（10 mg/L）1.0 mL后，再分别用超纯水定容至10 mL，配置成Gln浓度分别为10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L，内标（IS）浓度为100 μg/L的系列标准溶液。将系列标准溶液分别取0.5 mL于5 mL离心管中，加入1.5 mL 0.1%甲酸甲醇，过0.22 μm滤膜，形成标准工作溶液，待测。

1．2．4 液相色谱-串联质谱条件

（1）液相色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）， 流动相为0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）， 流速0.4 mL/min，进样体积5 μL， 柱温40 ℃。液相色谱梯度洗脱程序： 0～0.5 min，10%A；0.5～3.2 min，1 0%A～6 0%A；3.2～3.8 min，60%A；3.8～4.0 min，60%A～10%A；4.0～4.2 min，10%A。

表2 试验方法的日内和日间精密度（n=33）

图1 基质效应曲线图

（2）质谱条件

离子源为电喷雾电离E S I（+）， 离子源接口电压3.5 kV，脱溶剂气流量800 L/h，锥孔反吹气流量150 L/h。

碰撞气为氩气，脱溶剂管温度350 ℃，离子源温度150 ℃，毛细管电压3.2 kV；低端分辨率1为2.75 V，低端分辨率2为2.73 V，高端分辨率1为14.80 V，高端分辨率2为14.71 V；离子能量1为0.1，离子能量2为0.6；扫描模式为多反应监测模式。

2 结果与分析

2．1 质谱条件优化

分别将Gln及内标IS配制成200 μg/L的标准溶液，不接色谱柱，使用两通连接液相色谱与质谱，在正负离子模式下分别进行一级质谱扫描，选择合适的母离子和电离方式。结果表明，对于2 种化合物，信号最强的为正离子模式下的准分子离子峰[M+H]+。确定母离子后，进行二级质谱扫描，选取丰度较强、干扰较小的2 个子离子分别作为定性及定量离子，并进一步优化各离子对的质谱参数，优化后的质谱参数见表1。

2．2 基质效应

将基质进行系列稀释（1 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100倍）后配制浓度为100 μg/L的溶液来评价基质效应，以峰面积为纵坐标、稀释倍数为横坐标作曲线图（图1），系列稀释基质配制的100 μg/L Gln溶液与100 μg/L Gln标准溶液的峰面积偏差为0.4%～4.4%，小于10%，因此基质影响可不予考虑。

2．3 方法线性范围和定量限

Gln标准工作液的浓度依次为10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L，内标物IS的浓度为100 μg/L。以标准物质和内标的峰面积比为纵坐标，两者的浓度比为横坐标绘制标准曲线，在10～500 μg/L范围内，线性回归方程为y＝1.4933x＋4.4937，相关系数（R2）为0.9997，线性关系良好。

表3 试验方法的中间精密度（n=12）

表4 试验方法的回收率（n=18）

取样量为1.0 g，样品中谷氨酰胺含量为10 μg/g的色谱图中信噪比（S/N）为144，通过计算得出，稀释10 倍后，符合S/N接近10，因此方法的定量限为1 μg/g。

2．4 精密度和回收率

2．4．1 日内和日间精密度

取同一样品，做11 次平行试验（n＝11），按1.2.2样品处理步骤制成供试品溶液，按照1.2.4的液相色谱-质谱检测条件进行测定，测定时间为3 d。根据当日标准曲线，得到样品的Gln含量，计算日内RSD分别为0.77%、1.74%、1.42%，日间RSD为1.68%（表2）。

2．4．2 中间精密度

取同一样品，由甲、乙两个人分别在不同时间依次测定，6 次平行试验（n=6），按1.2.2样品处理步骤制备供试品溶液，进行UPLC-MS/MS分析，根据当日标准曲线，得到样品的Gln含量，计算RSD分别为0.56%和0.55%（表3）。

2．4．3 回收率

取同一样品，添加Gln对照品适量（相当于样品中Gln含量的60%、115%、190%，n=6），按1.2.2样品处理步骤制成供试品溶液，进行UPLC-MS/MS分析。根据当日标准曲线，得到样品的Gln含量，计算方法的准确度。Gln低、中、高3 个浓度的准确度分别为93.0%～103.6%、94.7%～101.0%、98.3%～103.6%，平均回收率为98.7%（表4）。

表5 试验方法的稳定性（n=12）

表6 不同乳制品中Gln的含量（n=18）

2．5 稳定性

取同一供试溶液分别在0 h、4 h、8 h、24 h进样3 次，比较峰面积，结果显示峰面积基本不变，RSD为5.8%（表5），表明在24 h内，供试品溶液基本稳定。

2．6 实际样品测定

用本文方法对市售和自采的6 份样品（包括鲜牛乳、鲜羊乳、鲜人乳、牛乳粉、牦牛乳粉、羊乳粉）进行检测，均可检出Gln（表6），其中鲜人乳中Gln含量较高，为鲜牛乳的40余倍。

3 结论

本文通过优化提取条件、液相条件和质谱条件，建立了检测乳基食品中谷氨酰胺的基于稳定同位素的内标超高效液相色谱仪-串联质谱法（UPLC-MA/MS）。该方法前处理简单，检测准确度和灵敏度高，回收率和重复性好，色谱分离时间较现有文献报道相比明显缩短，适合大批量样品的定量检测。