两种方法测定婴儿配方奶粉中维生素H含量的比对研究

文/何 娜

（黑龙江省完达山乳业股份有限公司）

维生素H（Vitamin H）又称维生素B7、生物素、辅酶R，是一种水溶性含硫维生素，属于B族维生素[1]。维生素H是合成维生素C的必需物质，是脂肪和蛋白质代谢不可缺少的物质，是维持人体正常功能和自然生长所必需的水溶性维生素[2]。婴儿缺乏维生素H会产生严重后果，因此必须在婴儿配方奶粉中强化维生素H。

维生素H的测定方法主要有仪器法、ELISA酶联免疫法、微生物法等[3，4]，其中微生物方法最灵敏且应用较为广泛。目前，维生素H的微生物检测方法主要是国家标准方法和试剂盒方法[5]。本文采用《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》（GB 5009.259-2016）和VitaFast® Vitamin B7（Biotin）试剂盒（R-Biopharm公司生产）对市售10 份婴儿配方奶粉中维生素H含量进行检测比对研究[6，7]。

1 试剂和材料

1．1 试验样品

市场在售的含维生素H的婴儿配方奶粉，10 份。

1．2 试剂和菌种

维生素H标准品（C10H16N2O3S），纯度≥9 9%；乳酸杆菌肉汤培养基，乳酸杆菌琼脂培养基，维生素H测试用培养基；氯化钠，氢氧化钠，无水乙醇，盐酸，柠檬酸盐，硫酸；植物乳杆菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）；VitaFast®Vitamin B7（Biotin）试剂盒。

1．3 仪器

酶标仪，电子天平，全自动新型生化培养箱，立式压力蒸汽灭菌器，离心机，METTLER综合测试仪，722可见分光光度计。

2 试验方法

2．1 国家标准方法 [8]

2．1．1 菌种制备

将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum（ATCC 8014）转移到乳酸杆菌琼脂培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出后接种到乳杆菌琼脂培养基中，37 ℃培养箱中培养24 h，使菌株活化，在试验之前连续接种2～3 代以确保菌株最佳生存力。使用接种环将活化菌株转移到灭菌的乳杆菌肉汤培养基中，37 ℃培养箱中培养20 h。取出后，将菌种悬浮液离心，弃去上清，然后用氯化钠溶液摇动后离心，弃去上清，重复3 次。最后，用氯化钠溶液稀释至透光率为80%。

表1 标准曲线制作方法

表2 待测液制作方法

2．1．2 试样提取

称量适量样品至250 mL锥形瓶中，加入100 mL硫酸溶液，121 ℃水解30 min，冷却后用氢氧化钠溶液调节pH值至（4.5±0.2），随后转移至250 mL容量瓶中并用水定容至刻度。过滤后，取出5 mL滤液，加入20 mL水，用氢氧化钠溶液调节pH值至（6.8±0.2），转移至100 mL容量瓶中，用水定容。

2．1．3 标准曲线制作

准确称取维生素H标准品100 mg，用50%乙醇溶液溶解，转至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度。随后稀释为0.2 ng/mL和0.1 ng/mL工作液备用。将水、标准曲线工作液和维生素H测定用培养基按表1顺序加入培养管中，3个平行。

2．1．4 待测液制作

将水、样品溶液和维生素H测定用培养基按表2顺序加入培养管中，3 个平行，每个样品都需要有样品空白管。

2．1．5 接种和培养

所有试管均用小钢帽覆盖，置于蒸汽灭菌器中，121 ℃灭菌5 min。灭菌后快速冷却至室温，并在无菌条件下将一滴菌悬液接种到每个测定试管中，其中标准曲线管未接种空白，样品空白不添加菌悬液。随后37 ℃恒温培养箱中培养20 h。

2．1．6 测定和结果计算

将培养的测定管晃动均匀，使用1 cm厚比色皿在550 nm处通过接种空白管将透光率调节至100%，然后依次测定标准系列管和样品管的透光率。以标准系列管维生素H浓度为横坐标，透光率为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中维生素H含量根据式（1）计算，式中X为样品中维生素H含量（μg/100 g）；Cx为样品试管中维生素H的浓度平均值（ng/mL）；f为样液稀释倍数；m为样品质量（g）。

2．2 试剂盒方法

2．2．1 样品处理

称取1 g奶粉样品放入至50 mL无菌试管中，加入40 mL无菌水并摇匀，调节pH值至（8.0±0.2），充分混合，在95 ℃水浴中提取30 min，每5 min摇一次，迅速冷却至室温[9]。在无菌条件下，将1 mL样品通过0.2 μm无菌滤膜器过滤到2 mL无菌管中，再根据样品中维生素H含量用试剂盒中提供的无菌水进一步稀释样品至合适浓度，稀释后的样品用于检测[10]。

2．2．2 标准溶液的配制

打开维生素H标准品，在标准品瓶中加入2 mL无菌水，充分溶解，即配成标准浓缩液，按表3依次将无菌水和标准浓缩液分别加入到2 mL离心管中。

2．2．3 培养基制备

用镊子从培养基中取出干燥剂，加入10 mL无菌水，充分摇匀，95 ℃水浴5 min，期间摇动2次。随后迅速冷却至室温，将培养基通过0.2 μm无菌滤膜过滤到15 mL无菌离心管中。

2．2．4 接种和培养

取150 μL维生素H培养基加入孔中，然后将150 μL标准品或样品加入指定孔中，用粘性箔盖住微孔条，37℃下于暗处充分封闭和孵育48 h。

2．2．5 测定和结果计算

取下粘性箔，用酶标仪读取630 nm处吸光度值，绘制标准曲线，其中维生素H标准品含量为横坐标，吸光度值为纵坐标。用式（2）计算样品中维生素H的含量，式中X为样品中维生素H含量（ug/100 g）。

表3 标准溶液配制方法

表4 两种方法测定维生素H含量的结果比对

图1 国家标准方法测定维生素H含量的标准曲线

图2 试剂盒方法测定维生素H含量的标准曲线

3 结果分析

3．1 标准曲线线性关系

以维生素H质量分数为横坐标，透光率或吸光度值为纵坐标，国家标准方法和试剂盒方法绘制的标准曲线分别见图1和图2。两种方法均具有良好的线性关系。国家标准法测定维生素H的标准曲线回归方程为y＝81.671x2－160.98x＋89.334，相关系数R2＝0.9978；试剂盒法测定维生素H的标准曲线回归方程为y＝-1.1445x2＋1.7981x＋0.0412，相关系数R2＝0.9982。

3．2 两种方法测定结果比较

国家标准方法和试剂盒方法对市售10 款婴儿配方奶粉的测定结果见表4，两种方法的测定值相近，前者测定样品维生素H含量的相对标准偏差（RSD）为0.97%～7.31%，后者RSD为0.62%～5.88%，均符合相关标准，测定结果准确可信。

4 讨论

两种方法的测定结果均满足《食品安全国家标准 婴儿配方食品》（GB10765-2010）的规定[11]。国家标准方法测定维生素H含量需要前期将植物乳杆菌培养到最佳状态，相对耗时，且测定结果与植物乳杆菌的活力关系很大，而试剂盒方法测定维生素H含量操作相对简单，且菌落已经提前包被在96 孔板上[12]，减少了操作引起的误差，可提高测定准确性，并减少测定时间。