不同产地拉萨大黄HPLC指纹图谱

徐晨阳， 郭明里， 方 芳， 李 宁∗， 龚云麒∗

（1.云南中医学院，云南昆明 650500；2.昆药集团股份有限公司，云南昆明 650100）

拉萨大黄为蓼科大黄属植物拉萨大黄Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao的干燥根及根茎[1-3］， 生于海拔 3 800 ～ 4 600 m 的山坡草地[3］，产于西藏拉萨、林周、曲松。据 《中华藏本草》记载，其属于亚大黄的一种，亚大黄 （藏语曲匝）是蓼科大黄属8种植物的根及根茎，具有清腑热、泻疫疠、消肿、愈疮，治腑热、胆热、瘟病时疫、腹痛、便秘的作用[4］。研究表明，拉萨大黄有多种活性成分，其中所含有的曲札茋苷、虎杖苷、白藜芦醇[5］等二苯乙烯类化合物表现出突出的药理活性。二苯乙烯类化合物具有抗衰老、抗氧化、提高免疫功能、防止动脉硬化、保护肝脏等作用[6-13］。由于药材受限于产地、栽培方法等因素，其在有效成分含有量、功效、作用上可能存在一定的差异[14-16］。目前，有关拉萨大黄的含有量测定已有报道[17-18］，但指纹图谱研究较少，仅凭个别化学成分的含有量难以全面地、客观地评价拉萨大黄的质量，且存在缺乏对共有峰进行定性等问题。本实验建立拉萨大黄的HPLC指纹图谱，同时采用对照品对其共有峰进行归属，用于全面评价拉萨大黄的质量。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪 （包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器）（美国安捷伦公司）；CP225D分析天平、BD221S分析天平 （德国Sartorius公司）；SHB-Ⅲ循坏水式多用真空泵 （郑州长城科技工贸有限公司）；Milli-Q超纯水机 （德国Millipore公司）；5510E-DTH超声波清洗器 （美国必能信公司）。

1.2 试剂与材料 色谱纯乙腈 （德国默克股份两合公司）、色谱纯甲醇 （德国默克股份两合公司）、磷酸 （分析纯）、超纯水。虎杖苷对照品 （批号111575-200502）购自中国食品药品检定研究院，曲札茋苷 （批号 20120715）、白藜芦醇 （批号20140920）、去氧土大黄苷 （批号20140623）对照品为昆药集团股份有限公司药物研究院自制。

20批拉萨大黄药材，详细信息见表1。所有样品经昆药集团股份有限公司李宁博士鉴定为正品，标本保存于昆药集团股份有限公司药物研究院。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 取样品粉末 （过3号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇 50 mL，称定质量，超声处理 （功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取曲札茋苷、虎杖苷、白藜芦醇、去氧土大黄苷对照品适量置于棕色量瓶中，用75%甲醇溶解并稀释配制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即为曲札茋苷、虎杖苷、白藜芦醇、去氧土大黄苷对照品溶液。

2.3 色谱条件 Grace Apollo C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长319 nm；柱温20℃；体积流量1.0 mL／min；流动相乙腈 （A） -水 （含0.1%磷酸，B），梯度洗脱 （0～18 min，15%A；18～30 min， 20%A； 30～45 min， 30%A； 45～50 min， 50%A； 50～55 min， 30%A； 55 min， 15%A）；理论板数按曲札茋苷峰计算应不低于5 000。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录165 min色谱图，见图1，主要成分已于55 min内全部流出。因此规定分析方法为分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录 55 min色谱图，即得。

图1 样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of sample

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一批号样品 （批号20160130），按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3”项条件下连续进样6次，测得各色谱峰相对保留时间RSD小于1%和相对峰面积RSD小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批号样品 （批号20160130），按 “2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，在 “2.3”项条件下进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD小于1%和相对峰面积RSD小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份批号样品 （批号20160130），按 “2.1”项下方法制备供试品溶液，在 “2.3” 项条件下，于0、1、2、3、9、22、26、39 h进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD小于1%和相对峰面积RSD小于3%，表明供试品溶液在39 h内稳定性良好。

2.5 HPLC指纹图谱建立

2.5.1 HPLC指纹图谱 取不同批次拉萨大黄药材共20批，分别按照已建立的拉萨大黄指纹图谱分析方法进行分析，得到各批药材的HPLC指纹图谱，见图2。

图2 20批样品HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of twenty batches of samples

2.5.2 相似度分析 以20批样品的色谱指纹图谱为基础，使用药典会推荐的 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012.130723进行数据处理，见图3，得到共有模式指纹图谱。通过比较20批药材的色谱图，确定了9个共有峰，见图4。分别生成20批样品的共有模式、野生品的共有模式、栽培品的共有模式。

对20批样品HPLC指纹图谱进行相似度分析，以20批样品的共有模式为参照，得所有批次与共有模式的相似度均在0.95以上。野生品平均相似度为0.983，栽培品平均相似度为0.988。

以12批野生样品的共有模式为参照，分别计算20批药材的相似度，得所有批次药材与共有模式的相似度均在0.95以上。野生品平均相似度为0.982，栽培品平均相似度为0.987。

以8批栽培样品的共有模式为参照，分别计算20批药材的相似度，得所有批次药材与共有模式的相似度均在0.90以上。野生品平均相似度为0.971，栽培品平均相似度为0.993。

2.6 相对保留值系统对指纹图谱评价

2.6.1 内参照峰选择 拉萨大黄指纹图谱中的1号峰经与对照品对照，确定为曲札茋苷。该色谱峰与相邻的色谱峰分离良好，且为各批拉萨大黄药材中所共有的色谱峰。因此确定其为内参照峰。

图3 各样品共有模式图Fig.3 Common models of various samples

2.6.2 相对保留时间 相对保留时间是色谱指纹图谱定性的依据，以1号峰的保留时间为标准，其他色谱峰的保留时间与之相比，从而求得各色谱峰的相对保留时间。相对保留时间体系将波动性较大的保留时间转变成稳定性较好的相对保留时间，有助于建立各样品统一的定性依据。在本研究中，各共有峰标识的保留时间和相对保留时间与20批药材共有模式相同。

2.6.3 相对峰面积 相对峰面积是色谱指纹图谱定量的依据。以1号峰的峰面积为标准，其他色谱峰面积与其相比，由此得到一系列的面积比值，这些归一化面积表达了各样品所含成分之间量的关系，该数据可用于待测样品与标准药材间相似性的量化描述，提高了样品间的可比性和比较结果的可信性。

本研究对拉萨大黄指纹图谱中9个共有峰的保留时间、相对保留时间，各色谱峰相对峰面积比值范围进行了统计计算，见表2。拉萨大黄20批药材共有峰的相对峰面积分布在一个较宽的范围内，最大RSD达到158.84%。其中3号和8号峰变化幅度最大，其次为4号、5号和9号峰，7号峰（除1号曲札茋苷色谱峰以外最大的色谱峰）相对稳定。相对峰面积的变化客观反映了化学成分的批间差异。

表2 16批样品共有峰相对保留时间及相对峰面积Tab.2 The relative retention time and relative peak areas of common peaks of sixteen batches of samples

2.7 共有峰指认 取曲札茋苷、虎杖苷、白藜芦醇、去氧土大黄苷对照品溶液，按照拉萨大黄药材指纹图谱分析方法对照品进样分析，通过对照保留时间对拉萨大黄指纹对照图谱中的色谱峰进行指认和标定，鉴定了3个共有峰 （曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黄苷），和1个非共有峰 （白藜芦醇），见图4。

2.8 含有量测定 在拉萨大黄指纹图谱研究的基础上，以外标一点法对曲札茋苷和去氧土大黄苷进行了含有量测定，见表3。对曲札茋苷，拉萨大黄指纹图谱的分析方法与拉萨大黄质量标准 （昆药集团股份有限公司企业内控标准）中曲札茋苷的含有量测定方法完全一致，可视为定量研究。对于去氧土大黄苷，本研究以指纹图谱的结果计算去氧土大黄苷的含有量，没有进行检测限、定量限、加样回收率等方法学考察，因此可视为半定量研究。

20批拉萨大黄药材曲札茋苷的平均含有量为4.36%，其中野生品的平均含有量为4.49%，栽培品的平均含有量为4.15%。20批拉萨大黄药材去氧土大黄苷的平均含有量为3.13%，其中野生品的平均含有量为3.44%，栽培品的平均含有量为2.68%。

表3 各成分含有量测定结果 （%）Tab.3 Results of content determination of various constituents（%）

图4 各样品HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various samples

3 小结

本研究建立了拉萨大黄药材的指纹图谱分析方法，对20批拉萨大黄药材进行了测定。用相似度评价软件和相对保留值系统对结果进行了分析评价。并对指纹图谱中的曲札茋苷、虎杖苷、白藜芦醇、去氧土大黄苷4个色谱峰进行了标定。在此基础上，对曲札茋苷和去氧土大黄苷进行定量研究。

结果表明，拉萨大黄栽培品和野生品的化学成分相似，具有较好的化学等同性。各成分的具体变化规律有待更多批次样品数据的积累与比较。本研究建立的分析方法可为拉萨大黄的综合质量评价提供参考。