尼克酸治疗恶性黑素瘤的相关机制研究

陈 龙 ，高 涛 ，唐海燕 ，李彦希 △

（1.梁平区人民医院神经内科，重庆，405200；2.重庆市中医院皮肤科，重庆，400011）

皮肤黑素瘤是来源于神经嵴表皮黑素细胞转化而成的肿瘤，是目前全球死亡率最高的皮肤肿瘤，在2015年黑素瘤全球患病人数高达351 880人，为5/10万[1]，每年发病率都在持续增长，且特别容易发生转移，高转移性是黑素瘤最重要的特征，也是区别于其他非黑素瘤上皮来源的皮肤癌特征之一[2]。过去20年，我们对黑素瘤侵袭的一般机制和黑素瘤特异性机制的理解都有了显著的提高，但迄今为止还没有有效的治疗策略来应对黑素瘤细胞的侵袭特性。黑素细胞来源于神经嵴，在发育过程中多种信号因子的作用下，迁移到毛囊、皮肤、粘膜等处，迁移过程中最重要的环节就是EMT(epithelial-mesenchymal transition上皮细胞-间充质转化)，EMT过程通过破坏粘附连接和紧密连接来加速上皮细胞和细胞粘附的降解,最早在1980年由Elizabeth Hay提出[3]，他在原始的鸡胚中观察到上皮细胞向间充质细胞过度的现象。在此过程中，细胞的粘附、极性、迁移等属性都会发生改变，上皮细胞会失去它们的粘附性和极性，重组他们的细胞骨架，在一些重组细胞形态和重组基因的表达的信号分子也会随之改变。EMT过程中间质标记如Snail1表达增加，上皮性标记如E-cadherin则下调，这一过程已被证明在正常发育过程如中胚层和神经嵴迁移是至关重要的[4-5]。在伤口愈合、纤维化及肿瘤转移过程中也有着上述过程[6-8]。EMT赋予肿瘤细胞的迁移、侵袭、干细胞样的属性，很大程度上是肿瘤免疫抑制和复发的重要原因[9-10]。因此，抑制EMT在癌症治疗的诸多方面都非常关键。

尼克酸（Nicotinic acid，NA）又名维生素B3，烟酸，或维生素PP，是一种水溶性维生素，维生素B家族成员之一，本研究通过体外实验探讨尼克酸对B16-F10黑色素瘤细胞迁移是否有抑制作用，以及不同浓度尼克酸对黑素瘤细胞的影响及相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 主要试剂与仪器 胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公 司，DMEM购自美国Hyclone公 司，尼克酸、台盼蓝购自美国Sigma-Aldrich 公司，Transwell小室购于美国Corning公 司，光学显微镜购自日本Olympus公司。TRIzol、逆转录试剂盒、SYBRⅡ购自日本Takara公司，细胞计数仪购自Bio-Rad公司。引物由上海嘉根生物科技有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养B16-F10细胞以含10%FBS的DMEM培养基培养。传代后置于5%二 氧化碳培养箱37℃正常培养备用。

1.2.2 Transwell体外迁移实验 选用 8.0μm孔径的Transwell小室进行实验。预先将B16-F10细胞饥饿处理2h，胰酶消化，配制成无血清细胞悬液(细胞浓度为105个/mL)。取100μL细胞悬液加入Transwell上室。然后取含有10% FBS的DMEM培养基500μL加入下室。再向上室加入不同量尼克酸PBS溶液，形成1μM,5μM,10μM三个浓度梯度，对照组加入相当量PBS。5%二氧化碳培养箱37℃正常培养24h。棉签擦去上室膜内细胞，甲醛固定10min；0.1%结晶紫 室温 染色3min，蒸溜水漂洗3*5min。Transwell小室置于显微镜下观察膜下表面细胞，以膜下细胞的数量表示黑色素瘤细胞迁移能力，随机选取视5个视野拍照计数，求平均值。以上实验重复5次。

1.2.3 细胞迁移相关基因表达变化 应用RT-PCR技术，提取取对照组及10μM尼克酸干预24h组细胞总RNA，以RNA为模版，通过逆转录试剂盒获得cDNA。再以cDNA为模版进行PCR扩增，以检测相关目的基因表达水平。每次两个副孔取平均值，实验重复四次。Snail1、snail2、twist、e-cardherin及β-actin基因引物序列见表一。

1.2.4 细胞活率检测 取对照组及10μM尼克酸干预24h组细胞悬液（细胞浓度为106个/ml），与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀，在三分钟内，通过细胞计数仪分别计数活细胞和死细胞。细胞活率计算方法为：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数死细胞总数）×100%。

1.2.5 数据分析 采用SPSS17．0统计软件进行数据统计分析。所得数据以均数SEM表示。组间均数采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 尼克酸干预对细胞迁移的影响

通过Transwell体外迁移实验我们发现，尼克酸对B16-F10黑色素瘤细胞的迁移有明显的抑制作用，且呈浓度依耐关系（图1）。在尼克酸干预浓度为10μM时，抑制细胞迁移效果最明显（*P＜0.05, **P＜0.01）。

图1

2.2 尼克酸干预对细胞迁移相关基因表达影响

10μM尼克酸干预组与对照组相比，促进肿瘤细胞迁移的相关基因snail2和twist表达明显减少(P＜0.01)，而抑制肿瘤细胞迁移相关基因E-cardherin明显增加（P＜0.05）。

图2

2.3 尼克酸干预对细胞活率影响

实验发现，10μM尼克酸干预组与对照组相比，细胞活率统计无明显差异。提示10μM尼克酸可显著抑制B16-F10细胞迁移，但并不影响细胞的存活。

图3

表1 相关基因引物序列表

3 讨 论

黑素母细胞高度活跃，在整个胚胎中迁移，定值于表皮基底层，最终在那里分化成成熟的黑素细胞，与表皮角化细胞均保持恒定关系。这种恒定关系主要通过钙粘蛋白（E-cardherin、N-cardherin等）、连接蛋白和其他粘附受体使黑素细胞和周围角质细胞紧密联系[11]，每一个黑素细胞通过树突与30-40个相邻的角质形成细胞接触，形成粘附结构，其形态、生长、粘附和迁移都受控于邻近的角质形成细胞。在黑素瘤的早期，重新活化的黑素瘤细胞在表皮中开始不受控制的增殖，表现为皮肤原位癌[12]，但这些黑素瘤细胞很容易受到微环境和一些分子信号的影响，刺激其侵袭性和诱导血管生长，此时，周围角质细胞失去对黑素瘤细胞的粘附作用，不仅如此，表皮细胞还产生肝细胞生长因子(HGF)，下调E-cadherin，分泌基质金属蛋白酶9(MMP-9)，加速基底膜的破坏，并激活Notch信号，通过上调miR-222/221诱导侵袭 。瘤细胞进入真皮后主要通过淋巴（16%-47%）和血管转移（高于70%）。因此治疗黑素瘤的关键在于抑制瘤细胞的转移和侵袭。

尼克酸是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其磷酸形式NADP的组成部分，能调控细胞的能量代谢，影响氧化应激，调节细胞存活和死亡的多种途径[12]。NA参与细胞粘附、极性、迁移、增殖和分化的调控等多种活动，最重要的是对分化细胞具有去分化功能。在烟酸缺乏症的患者中非常重要的特征是对紫外线敏感，这是因为缺乏烟酸导致的对紫外线的损伤修复不足造成的，体内研究表明口服烟酸可降低紫外线诱导的免疫抑制，加速紫外线照射的人HaCaT角质形成细胞和体外皮肤的DNA修复，降低皮肤癌的发病率。双盲随机对照试验证实烟酸能明显降低日光性角化的发病率 。Ma et al.认为高浓度的NA (50mM)能调节辣椒素受体TRPV1-4的活性，超过50mM的NA 能使3T3细胞的细胞骨架分解，并能抑制爪蛙细胞内黑素的转运 。

本研究通过体外实验发现尼克酸能明显抑制B16-F10黑色素瘤细胞的迁移，且呈浓度依耐关系，在尼克酸干预浓度为10μM时，抑制细胞迁移效果最明显。细胞迁移能力降低预示着转移能力下降，因此降低了肿瘤的侵袭性，黑素瘤治疗的关键在于抑制瘤细胞转移，因此为NA体外治疗MM提供了有力的理论依据。三期临床实验中每日给予1g烟酰胺的口服剂量，对386个KC患者观察发现烟酰胺对KC有化学防护作用 ，但在体外黑素瘤患者需要口服的烟酸剂量目前还无文献报道，需进一步深入研究。

锌指蛋白家族中的Twist、Snail是调节EMT重要的转录因子。在黑素瘤的发病的分子机制中，snail介导的E-cadherin的下调，E-cadherin的下调被认为是癌症进展的一个关键特征，与皮肤恶性黑色素瘤预后不良正相关，使得与角质细胞的粘附力下降 ，此外snail还可以通过诱导免疫抑制加速黑素瘤的转移 。在MM 过程中，干扰这些关键蛋白的表达或功能，使得细胞信号改变，进而诱导上皮细胞失去上皮特性。细胞连接主要为粘附连接，紧密连接和桥粒连接，细胞粘附蛋白对于维系上皮细胞特性尤为重要，细胞间粘附力下降还会引起细胞骨架的改变，这又反之加速细胞粘附力的下降。此外，本研究发现NA能使EMT上游转录因子snail泛素化和退化，进而使得下游的E-cadherin增高，增加细胞间的粘附。 E-cardherin上调，E-cardherin主要位于上皮组织，从而增大细胞间的粘附，有效阻止了黑素瘤细胞的活性，因此尼克酸干预下，B16-F10黑色素瘤细胞的迁移明显受阻。因此，在体外烟酸还能抑制肿瘤细胞的迁移，综上所述，NA能在体外抑制黑素瘤细胞的迁移，这为NA治疗黑素瘤提供了又一理论基础。

综上所述，本研究从分子机制深入讨论了体外尼克酸通过对上游转录因子的影响，使得下游粘附蛋白发生变化，进而改变细胞粘附，抑制黑素瘤细胞的迁移，为治疗黑素瘤提供了新的临床思路和理论基础。