微藻诱变育种的研究进展

□孙仁旺 吕 旭 张红兵

一、微藻诱变育种

(一)微藻制备原生质体的诱变育种。微藻细胞外存在一层厚厚的细胞壁，对细胞起到很好保护作用的同时，也对紫外线有较强的阻碍。采取复合酶的方法将微藻的细胞壁去除后所得到的原生质体[1]，再进行诱变育种，这便是第一种诱变育种方法。紫外诱变因其操作简单、效果明显，国内外学者研究也越多。同时辅助以原生质体诱变技术[2]，增加了微藻对紫外线的敏感程度，使紫外诱变的效果更佳。

1.方法。将微藻细胞在紫外处理之前，按复合酶法去除细胞壁[3]所得到的原生质体薄薄的铺于已灭菌的培养皿中，迅速放入紫外定时诱变仪中，设置照射距离，并设置不同照射时间梯度，分3个平行组。藻液黑暗放置过夜后，稀释至合适浓度，细胞壁再生，涂平板，置于光照培养箱，设置光照强度、光照温度、光照周期等参数进行培养，计算致死率[4]。

2.突变型的筛选。对于耐高温微藻的筛选，以高温为选择培养，简单、直接且高效。微藻细胞经过紫外诱变，统一做黑箱处理，最终以结果为出发点，不管过程中微藻是否发生了突变、突变是正向还是反向，只要认为以高温选择培养的能在高温环境下存活下来的纯培养，即认为是得到了理想的突变型。在此基础上依据不同指标再评价此次诱变是否理想，与现有相比能否满足工业生产，再进行分子生物学上的鉴定。后期对突变藻株进行性质研究，如研究生物量或按照已优化的Bligh-Dyer方法测定微藻的油脂含量[5～6]，测定含油量的变化[7]，来加以鉴定。后期通过测定细胞浓度[8]，绘制生长曲线对其进行突变型遗传稳定性的研究。

(二)微藻直接诱变育种。第二种方法便是直接对微藻进行诱变处理，通过初筛将目的微藻获得后根据实验需求直接实验或制备原生质体实验等。袁莎[9]做了相关实验研究，对拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata)和日本小球藻(Chlorellahirataii)先进行紫外(Ultraviolet)和EMS诱变，初筛出藻株(UN01、UN16、UN22、EN39、EN57和UC38、EC09、EC24、EC74)，将其作为第一轮改组的亲本藻株，进行第二轮基因组改组，按上述方法进行原生质体制备，分别进行种内PEG融合法，在筛选高产性状藻株，做遗传稳定分析。

1.微藻的紫外线诱变。分别取对数生长期的藻液平铺于已灭菌的培养皿中，在距离20W紫外灯照射光源40cm距离下，进行6个不同时间梯度的照射，每组做三个平行样。照射结束后，黑暗放置培养12h，防止光复性，随后一并转移至光照培养箱培养。待第3天后测其死亡率，选取死亡率接近于70%～80%的，确定最佳紫外诱变时间。

2.微藻的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变。取对数生长期的藻液于已灭菌的离心管中，低速离心收集藻细胞，分别加入0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%5个不同浓度的EMS溶液，每组做三个平行样，悬浮。半小时后加入5%硫代硫酸钠溶液终止诱变，低速离心去除EMS溶液，无菌水离心两次，再用已灭菌的新鲜培养基洗涤两次，黑暗放置培养12h，再转至光照培养箱培养，待培养一天后测其死亡率，选取死亡率接近于70%～80%的，确定最佳EMS诱变浓度。

3.诱变株的筛选。以产油脂微藻为例，按以上方法所确定出的最佳紫外诱变时间或最佳EMS诱变浓度对产油微藻进行诱变，为防止光复性，先黑暗放置培养12h，再转移至光照培养箱培养3天。将上述处理培养3天的微藻用已灭菌的液体培养基稀释涂布(根据实际操作需要)或划线于已灭菌的固体培养基上，置于光照培养箱中培养。待固体培养基上长出已经肉眼可见的微藻单藻落，用1μg/L的尼罗红染液染色，先黑暗培养24h,后在荧光显微镜下镜检观察染色情况。尼罗红是一类亲脂性的恶嗪类荧光染料，与脂类物质结合在激发波长530nm激发下显示桔红色，在紫外照射下显示红色，且颜色深浅即荧光强度与脂肪含量呈正相关[10]。尼罗红染色液先用正己烷定容成0.5mg/ml的母液，再用20%DMSO稀释1,000倍，过滤膜除菌，在配制实验所需浓度。镜检时将视野中明亮的单藻落用接种环挑取到含有2ml已灭菌液体培养基的离心管中扩培。后期通过将荧光镜检筛选得到的藻株连续转接多代，比较首代与末代的油脂含量，进行遗传稳定性分析，观察能否稳定遗传。

二、微藻诱变育种的研究展望

本文综述了微藻诱变育种的方法，虽有成功的案例，但迄今为止，基因组改组的应用在范围和方法上相对比较局限，大部分集中于微生物方面，而在动植物方面进展较少。基因诱变是一个可以获得生物体的外在复杂表型得到定向进化的功能强大的方法，可以弥补现实中表型较为单一的缺陷，但随着基因组学、蛋白质组学和分子生物学等学科的发展，越来越多的研究也将被广泛应用。目前许多已由基因诱变的都是进行蛋白质组学等研究的热门目标。相信在此基础之上，伴随着基因诱变技术的逐渐发展与成熟，蛋白质组学等的同步发展都将会进一步推动生物界的发展，更好地服务于生物界，带来更多的社会效益。