鸭疫里默氏杆菌疫苗研究进展

23 程振涛23 文 明23 周碧君23

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病防控与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

鸭疫里默氏杆菌病(Riemerella anatipestifer infection)又称新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症、鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemrellaanatipestifer，RA)引起的主要侵害雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病[1]。1～8周龄雏鸭对RA易感，其中以2～3周龄雏鸭最易感[2]。该病以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主要病变特征，病死率高达90%，给养鸭业造成巨大的经济损失。目前国际公认的RA血清型有21个，各血清型之间缺乏交叉保护，使得不同国家和地区、同一地区不同时期或同一养殖场可同时存在多种血清型或亚型的混合感染[3]。药物治疗和疫苗免疫是目前控制该病的主要措施。RA对多种抗生素敏感，但生产中长期大量应用抗生素药物致使其耐药性增强，对环境造成严重污染，对人类健康也造成威胁[4]。多年来，国内外学者都致力于RA疫苗的研究并作为防控该病的首选，目前国内外研制的RA疫苗有灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等。由于RA血清型众多，许多商品化的RA疫苗应用缺乏普适性，有一定区域局限性，影响了对疫情的防控。加大具有交叉保护性疫苗的研究力度及强化疫苗使用的宣传和推广将会进一步扩大疫苗的应用范围和影响力。本文综述了近年来RA疫苗的研究现状，并探讨RA疫苗今后的研究方向，为RA疫苗的研制和科学选择提供参考。

1 灭活疫苗

灭活疫苗是将人工分离培养的抗原(病原体)用甲醛等灭活后加入适当佐剂制成。当前国内市场中RA疫苗多为灭活疫苗，免疫效果都较理想[4]。不同产品间的差别主要在于血清型、佐剂和抗原含量不同。

1.1 单价灭活疫苗由于RA血清型众多，还有待确认的血清型或血清亚型，且各血清型间无明显交叉保护力，因此对于单价疫苗来说，必须根据不同地区间流行的血清型和流行菌株针对性地制备疫苗，才能获得良好的保护效果。赵朴等[5]从病鸭分离RA并制备蜂胶灭活疫苗，免疫后3～7 d即可产生部分保护(1/10～4/10)，14 d可完全保护(10/10)，到90 d仍可完全保护(10/10)。杨灵芝等[6]以10型 RA GN52株为菌种，采用改进的液体培养工艺进行增菌后制备油乳剂灭活疫苗免疫3日龄雏鸭，免疫后7 d用同源菌株攻击保护率可达70%，14 d达100%，至56 d免疫保护率仍可达80%；10日龄进行第2次免疫，3 d后免疫保护率达100%。王小兰等[7]用候选的YL4、JY4、CH3、CQ3、YXb12共5株RA分离株分别制备灭活油乳剂疫苗，分别于5日龄和18日龄对樱桃谷鸭进行2次免疫，免疫鸭均能产生高水平的RA特异性抗体，且对2LD50JY4或CH3攻毒能产生很好的保护效果，其中由CH3、CQ3、YXb12制备的灭活油乳剂疫苗对攻毒的保护率高达100%；同年又用SC-2、Yb2、Th4、JY-1、NJ-3菌株制备灭活油乳剂疫苗免疫5日龄雏鸭，2周后进行加强免疫，2免10～14 d后进行血清抗体检测及攻毒保护试验，结果表明不同菌株制备的疫苗均可使免疫鸭产生高水平的RA特异性抗体和攻毒保护力，但是攻毒保护性差异较大，NJ-3免疫后的攻毒保护性最好。嵇辛勤等[8]选用血清2型RA地方优势流行株为菌种，制备了稳定性和安全性较好的甲醛油乳剂灭活疫苗，免疫麻鸭后对其抗体滴度进行检测，免疫保护率达87.5%，高于商品化的同类灭活疫苗(62.5%)。

1.2 多价灭活疫苗由于不同地区RA流行的血清型不一致，而且在不同时期流行的血清型也可能不同，包括在同一鸭场甚至是同1批鸭群可能同时存在多个血清型，各血清型之间无交叉保护，考虑到菌体培养及内毒素等因素，疫苗生产中不可能加入全部血清型菌株，因此要发挥疫苗的最佳优势就应充分了解和弄清当地流行菌株的血清型，制备包含流行血清型的多价疫苗进行免疫。程安春等[9]将血清1、2、4、5型RA灭活制成四价铝胶复合佐剂疫苗，免疫雏鸭后可有效抵抗血清1、2、4、5型RA强毒的感染。傅元华[10]、孟超等[11]分别选用血清1、2型 RA制备二价油乳剂灭活疫苗，可有效保护鸭和鹅不被同型RA感染。谢永平等[12]研制的血清1、2、3型RA三价油乳剂灭活疫苗免疫保护期达50 d，可满足肉鸭养殖生产的需要。程增青等[13]选用血清1、2型RA菌株制成二价灭活疫苗，用5日龄樱桃谷鸭分别进行安全性和效力试验，结果显示疫苗安全、有效，攻毒保护率可达90%以上。王小兰等[14]采用血清1、2、10型RA(菌株分别为CH3、NJ-3和HXb2)制备RA三价灭活油乳剂疫苗，雏鸭经1次免疫后可产生RA特异性抗体，且血清抗体水平可持续10周以上；免疫后10周进行攻毒保护试验，可获得100%的免疫保护率。程龙飞等[15]选用血清2、11型RA制成二价灭活油乳剂疫苗皮下接种7日龄番鸭，免疫后14 d产生良好保护，保护率超过80%，免疫持续期可达60 d。Kang Min等[16]选用血清1、2型RA制成二价灭活油乳剂疫苗免疫雏鸭，对同源RA血清型再次感染能起到显著保护效果，免疫28 d后，IgA分析显示气管sIgA水平显著升高，达到了良好的免疫效果。

1.3 联合灭活疫苗当前国内肉鸭养殖散养户较多，由于缺乏良好的饲养管理、养殖环境污染严重、受应激因素刺激等，很容易被各种条件性致病菌(特别是大肠杆菌)感染发病，往往同时伴发或继发RA，从临床症状不易进行鉴别诊断。为更好应对这种混合感染，同时又要减少免疫接种次数过多引起的应激，进行多种病原联苗的接种就显得尤为重要。李振清等[17]用血清10型RA LQ09、血清1型RA YC11和鸭大肠杆菌优势血清型菌株O78型LQ06、O92型BX02作为菌种，采用液体培养工艺进行增菌后，制备鸭疫里默氏杆菌-大肠杆菌二联油乳剂灭活疫苗，对3日龄肉雏鸭免疫可产生良好的免疫应答，免疫后10日龄用同源菌株攻击保护率达70%，17日龄达80%，24日龄至出栏达100%；对7日龄肉雏鸭免疫也可产生良好的免疫应答，免疫后14日龄用同源菌株攻击保护率达80%，21日龄直至出栏达100%。秦绪伟等[18]选用血清1型RA和血清O78型大肠杆菌制备传染性浆膜炎-大肠杆菌病二联灭活疫苗，经性状检验、无菌检验、安全检验、效力检验全部合格，肉鸭1日龄免疫后14 d保护率均为90%以上，能有效保护低日龄商品肉鸭不受血清1型RA、血清O78型大肠杆菌的侵袭，免疫后7周仍有保护力。刘晓文等[19]选用鸭坦布苏病毒GDNS2010.1株、鸭源大肠杆菌O1株、血清2型RA强毒株研制成鸭坦布苏病毒-鸭大肠杆菌-RA三联灭活疫苗，通过不同免疫次数试验表明，免疫1次可产生抗体，免疫2次达到较好的保护效果，免疫3次保护率可达到100%，且能有效预防鸭坦布苏病毒、鸭大肠杆菌和RA引起的麻鸭产蛋下降。

在灭活疫苗生产过程中，通常添加各种佐剂作为非特异性免疫增强剂以增强疫苗的免疫保护效果，常用的佐剂主要有油乳剂、铝胶、蜂胶和黄芪多糖等，佐剂不同，疫苗的保护效果也不尽相同。陈洁等[20]从安全性和保护效果两方面对血清1型RA油乳剂、蜂胶及黄芪多糖灭活疫苗的保护效果进行比较，发现3种佐剂疫苗的保护率分别为92%、84%、96%，说明黄芪多糖灭活疫苗的保护效果最佳。吉凤涛等[21]对血清1、2、7型RA三价蜂胶灭活苗和油乳剂灭活苗的免疫保护效果进行评价，发现雏鸭免疫蜂胶灭活苗第3天即可产生部分抵抗力，疫苗的完全保护作用可持续至120 d；接种油乳剂灭活苗的雏鸭于免疫后10 d才开始表现出部分抵抗力，但疫苗的完全保护作用也可持续至免疫后120 d。比较2种佐剂疫苗的效果可以看出，蜂胶灭活苗具有产生诱导免疫保护作用速度快、免疫持续时间长等优点，而油乳剂灭活苗虽然免疫持续期较长，但诱导产生保护力的速度较慢。Zhang Yuewei等[22]采用左旋噻米唑(LMS)作为免疫增强剂进行改善小鸭的免疫系统，结果显示Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)和T淋巴细胞的增殖率均高于正常组。

灭活疫苗安全性好，不散毒，便于储存和运输，但不能将内源性蛋白抗原递呈给免疫系统，因而不能诱生细胞毒性T细胞反应(CTL)，而CTL可能在保护性免疫中起主导作用，故其保护效力不如弱毒活疫苗；由于灭活疫苗抗原成分含量不高以及灭活过程中主要抗原决定簇的丢失，因而常常需要多次接种；另外，应用佐剂可能对机体产生副作用，一些国家限制使用油佐剂。

2 弱毒活疫苗

弱毒活疫苗的抗原是致弱的活病原微生物，机体能迅速产生免疫力，但在兽用活疫苗产品中病毒类较多，细菌类较少，特别是RA活疫苗报道更少。由于人工致弱毒株偶尔会出现毒力返强现象、毒株间的交叉保护性差、易与野毒株发生重组等问题，或由于操作不当易造成人工散毒，RA弱毒苗的应用存在局限性，所以国内外学者对此研究较少。Sandhu T S等[23]利用筛选的自然弱毒株血清1、2、5型 RA菌株制成三价弱毒活疫苗，免疫北京鸭进行相关实验室及生产应用研究，1日龄北京鸭经饮水或气雾免疫1次均能产生有效保护力，免疫保护期最少可至42日龄；经实验攻毒和野外感染试验表明2种方法均可产生较好的保护作用；免疫后在饲料中添加0.044%金霉素或0.02%磺胺二甲氧嘧啶不会影响疫苗的效果。与油乳剂灭活苗相比，应用该疫苗不仅可以减轻疫苗注射造成的应激，还能减少注射次数，确保胴体品质。王小兰等[24]应用Yb2ΔpncA制备的血清2型RA弱毒活疫苗免疫7日龄樱桃谷鸭，1次免疫可以获得80%的免疫保护率，2次免疫可以获得90%的免疫保护率，表明Yb2ΔpncA可以作为RA弱毒活疫苗的候选菌株。

弱毒活疫苗不仅可以诱导机体产生体液免疫，而且还能诱导产生细胞免疫，免疫效果较灭活疫苗更好，但弱毒活疫苗可发生潜在感染，并有散毒的危险，故应特别注意弱毒苗菌株的安全性问题。

3 亚单位疫苗

亚单位疫苗主要是采用提取或其他生物工程方法将RA病原体中引发机体免疫应答的主要成分制备而成的疫苗。此类疫苗一方面减轻了常规全菌体疫苗存在的免疫副反应问题，另一方面为进行精确免疫及多种病原体的联合免疫提供了新的发展思路，同时还为解决RA各血清型间的交叉保护性问题提供了一种新的方式。在RA亚单位疫苗方面主要开展了以荚膜或外膜蛋白为亚单位成分的免疫研究，但大多还处在试验阶段，保护效果差异也很大，这可能与采用的提取方式及疫苗制备方式有关，有待于进一步研究。

3.1 荚膜免疫原性苏敬良等[25]对血清1型RA荚膜提取物的免疫原性进行了研究，结果表明荚膜粗提物和经过苯酚抽提纯化后的荚膜提取物经2次免疫7日龄北京鸭后，对同源细菌的攻毒保护率分别为90%、70%。吕敏娜等[26]将RA菌液分别用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)-无水乙醇法和高浓度氯化钠浸提法提取荚膜多糖，用经95%酒精浸提7 d以上的蜂胶作佐剂，制备成RA荚膜多糖亚单位疫苗，免疫雏鸭未见不良反应，免疫5日龄雏鸭14 d后用RA-L强毒株攻击，保护率达80%；免疫7日龄雏鸭6、12 d后分别以RA-L强毒株攻击，保护率分别为60%、100%；免疫8周后保护率仍可达88.3%；高浓度氯化钠浸提法的免疫效果比十六烷基三甲基溴化铵-无水乙醇提取法的免疫效果好。齐冬梅等[27]用制成的血清1型RA荚膜油乳佐剂疫苗免疫雏鸭后，对同源菌株的攻击保护率可达90%；通过与其他血清1型RA不同佐剂灭活疫苗免疫效力的比较发现，荚膜油乳剂苗的保护效果最佳，其次为油乳剂灭活苗、蜂胶灭活苗、无佐剂灭活苗。上述研究工作的开展为亚单位疫苗的研究提供了候选抗原，也为该类疫苗的研制奠定了基础。

3.2 外膜蛋白免疫原性苏敬良等[28]试验表明，RA的44 kD外膜蛋白可能是该菌的主要免疫原性蛋白之一；用外膜蛋白加弗氏佐剂免疫10日龄北京鸭，首免后2周进行2免，可诱导产生加强的抗体反应，抗体维持4周以上，经2免后对同源菌株攻击的保护率为100%。张克新等[29]用54 kD外膜蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，免疫8日龄雏鸭后第14 d进行2免，分别在首免前1 d，首免后第7、14 d，2免后第7、14、21、28 d采血检测，首免后第14 d可检测到有抗体产生，2免后第14 d抗体水平最高，平均效价达到640倍，第28 d时平均抗体效价仍可达到320倍。Huang Bin等[30]将血清15型菌株分子量为42 kD的重组外膜蛋白A(OmpA)和血清19型菌株分子量为45 kD的RA表面蛋白P45N' 免疫雏鸭，并通过免疫印记和ELISA法对免疫效果进行追踪，结果显示重组蛋白能够诱导免疫鸭产生抗体，但后续攻毒试验中免疫鸭并没有受到很好的保护。Chu Chun-Yen等[31]评估了含有OmpA的亚单位疫苗和含有CpG寡脱氧核苷酸(ODN)的质粒结构提供的免疫应答和保护作用，结果表明CpG ODN可在初次免疫后14 d内增强OmpA引起的体液免疫和细胞免疫，同源攻毒结果显示OmpA+CpG ODN疫苗免疫保护率达90%，可作为1种抗RA的亚单位疫苗进一步开发。

3.3 菌蜕疫苗细菌菌蜕是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳。由于菌蜕具有完整的膜抗原结构，可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，且成本低廉，易于大规模生产，制成的冻干苗在室温下可长期保存，免疫时因其本身就具有佐剂的性质，无需加入佐剂，因此菌蜕是1种非常理想的新型疫苗体系，能直接作为疫苗使用。董洪亮等[32]利用MAP制备的RA CH3菌蜕疫苗对樱桃谷鸭免疫有很好的保护效果，能有效抵抗同型RA侵害，并且从免疫保护水平来看免疫效果要优于甲醛灭活苗。

由于亚单位疫苗不含有核酸物质，因此与弱毒活疫苗相比安全性较高，并且有可能找到1种具有共同抗原的蛋白，以解决RA多种血清型之间缺乏交叉保护的问题；除此之外还有一大优势，即可与抗生素同用。缺点是免疫原性相对较差，且制造成本高，限制了其在临床上的广泛应用。

4 基因工程疫苗

作为兽用疫苗，亚单位疫苗由于成本过高而不太实用，基因工程疫苗则是较为理想的发展方向。在研制基因工程疫苗时，在亲本菌株的选择上要么是分离本地毒力较强的优势血清型，产生最大限度的保护；要么使用的疫苗含有多种血清型，尽可能地包括多种保护性抗原，可以提供更全面的保护。目前从RA中分离出的蛋白有：pCF1质粒的VapD1和VapD2基因编码的蛋白、pCF2质粒中插入序列ISRal编码的氨基酸残基转移酶、CAMP溶血素、OmpA、潜在表面蛋白(P45)、DNA复制蛋白(RC-PAs)等。Subramaniam等[33]克隆表达了RA中编码42 kD主要保护性外膜蛋白的OmpA基因，发现OmpA是1个保守且具有很强抗原性的蛋白，因而对于保护RA的感染很有价值，且不受血清型的限制。雷云等[34]成功构建了真核重组质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA和pcDNA3.1(+)-OmpA，免疫雏鸭后能刺激鸭体产生RA特异性抗体，对血清1、2型RA均有一定的交叉免疫保护作用；pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA免疫鸭后诱导产生的抗体水平和提供的免疫保护效率要高于pcDNA3.1(+)-OmpA免疫组鸭。袁彪等[35]成功构建了RAwza基因缺失株并证明了该基因与荚膜的形成相关；其研究结果得出wza基因的缺失导致RA的毒力下降了大约421倍，表明wza基因是RA的1个毒力基因。Zhao Xinxin等[36]通过敲除RACH-1(B739-2187)基因可以显著减少RA的毒力并为野毒株的再次感染提供100%的保护，表现出理想弱毒活疫苗的特性。Liu M等[37]研究表明B739_1343是RA-CH-1的毒力因子，用高剂量(100倍LD50)的野生型RA-CH-1菌株攻击雏鸭，免疫突变菌株RA-CH-1ΔB739_1343所制活疫苗可使免疫保护率达83.33%，表明突变菌株RA-CH-1ΔB739_1343可进一步作为抗RA的潜在弱毒活疫苗候选毒株。Dou Yafeng等[38]通过筛选随机Tn4351转座子突变体文库获得了RA突变株RA1062，并且其M949_RS01035基因被灭活，试验攻毒结果表明用灭活的RA1062菌苗免疫鸭可以有效地交叉保护免受毒力型血清1、2、10型RA的攻击。该研究表明M949_RS01035基因参与细菌表型，RA的毒力和基因调控，突变株RA1062可用作交叉保护疫苗候选物。这些结果为RA基因工程疫苗研究奠定了基础。目前对RA核酸疫苗研究的报道相对较少。黄国安等[39]以血清2型RA毒力蛋白相关基因VapD1为抗原基因构建了DNA疫苗，雏鸭经肌肉注射免疫后能抵抗同型RA毒株攻击，但免疫保护效果不及VapD1编码的蛋白质亚单位疫苗。随着对RA基因组的深入研究，将有更多的抗原基因用作DNA疫苗；RA核酸疫苗的研究，包括基因组功能研究、抗原基因的优化、表达载体的选择、核酸疫苗的佐剂应用、疫苗的运送体系等方面将更加深入。

5 展望

由于RA血清型众多，增加了RA免疫预防的难度，应及时进行RA血清型的监测工作，确定某地区的优势血清型，可为研制安全可靠的新一代多价疫苗提供指导。近年来，对RA的研究已经深入到分子生物学水平，RA相关的免疫原性基因和致病基因将逐渐被发现，疫苗的研发也逐渐多元化，亚单位苗、基因缺失弱毒苗和基因工程苗等新型疫苗有望在生产中得到实际应用。目前养鸭生产中对鸭疫里默氏杆菌病的防控仍有许多亟待解决的问题，探索研制出安全、有效、使用方便、适用性广的疫苗至关重要。