基于肠道微生物探讨哮喘发病的免疫机制及黄芪的干预作用*

刘 旭 张姝翌

哮喘是一种普遍的慢性呼吸道疾病，一般表现为气道慢性炎症，其中就包括部分免疫细胞，例如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、气道上皮细胞等。这些免疫细胞的异常可以引起呼吸道炎症性疾病。近些年来，随着大气污染及雾霾的广泛波及和遗传等因素的影响，哮喘的发病率及复发率呈直线上升的趋势。流行病学调查显示，十年间哮喘发病率平均上升了52.8%，这对患者、家庭和社会经济都造成了极其严重的影响[1,2]。迄今为止，吸入糖皮质激素(ICS)依旧是支气管哮喘最有效的治疗方法。然而多数临床报道显示，过量吸入糖皮质激素可能会造成药物依赖或耐药性以及其他不良反应，特别是对在儿童期发生哮喘的患者，因为吸入糖皮质激素的治疗方法会影响儿童的免疫系统，使其产生激素依赖性。因此，我们需要一种替代激素治疗的方法。最近，有研究提出了肠道菌群参与过敏性炎性疾病发生和发展的假说，并且可以通过检测肠道菌落的结构来预测患哮喘的风险。Brett Finlay[3]等分别采集了319个婴儿在3个月和1岁时的尿液及粪便样本，以及他们在1、3、5岁时的健康情况，通过使用高通量基因测序来检测样本中的肠道微生物水平，检测发现，缺乏四种肠道菌群(Lachnospira， Veillonella，Faecalibacterium，Rothia)的婴儿都在1岁时表现出了早期哮喘的症状。由此可见研究肠道微生物与哮喘的发生发展机制有着重要的意义，调控肠道微生物的组成还有可能成为预防或治疗哮喘的有效方法，从而提出了“肺-肠-菌”轴的概念。

1 哮喘发病中的“肺-肠-菌”轴

目前，哮喘的发病机制尚不明确，但关于T淋巴细胞分化转录的研究已成为探索哮喘免疫发病机制的主要方向，其中Th1/Th2失衡学说一直以来被奉为哮喘发病的主导核心理论。最新研究显示，Th17细胞、调节性T淋巴细胞及树突状细胞等也共同参与着哮喘免疫学的发病机制，即Th17/Treg的免疫失衡机制[4]。

研究认为，肠道微生物在维持人体肠道免疫平衡与能量平衡中同样起到至关重要的影响。且大量研究证实，肠道微生物不仅单单维持肠道免疫调节，还能影响到外周器官，例如肺[5]。研究发现，肠道微生物结构的改变和免疫平衡的失调与多种肺部疾病发病相关，例如抗生素的使用会造成肠道菌群的失调，最终会增加肺炎及Th2细胞诱导的哮喘[6]。肠道微生物的失调与多种肺部疾病相关，其中就包括过敏反应、哮喘和囊性纤维化。肺与肠的双向调节(称为肺-肠轴)最好的例子就是在肺部疾病中可以观察到肠道内菌群紊乱，而如今研究表明，服用益生菌可以对肺部疾病的愈合起到正向调节的作用[7]。以下分别从上述两种机制探讨肠道菌群在哮喘发病中的重要作用。

1.1 肠道微生物干预Th1/Th2失衡机制Th1/Th2分泌的细胞因子相互影响和制约所形成的相对动态平衡，共同维持着机体的免疫功能。哮喘发病的一个关键环节就是Th1细胞因子减少，Th2细胞因子增加。其中Th1细胞主要分泌IFN-γ、IFN-β、IL-2、IL-12等，主要功能是介导细胞免疫，并且以IFN-γ为代表性细胞因子，从而体现其生物学的效应；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等，主要功能是介导体液免疫，并且以IL-4为代表性细胞因子，从而体现其生物学效应。所以我们一般通过检测IFN-γ和IL-4的含量多少来反映Th1/Th2的细胞群的功能状况和分布范围[8]。IFN-γ作用于IFN-γ受体，激活信号传导因子STAT-1，进而激活Th1细胞的正向调控转录因子T-bet的表达，而T-bet又可以正反馈诱导IFN-γ基因的转录。T-bet转录因子还可以结合IL-4基因3’端沉默区复合反应元件，抑制IL-4基因表达。所以转录因子之间的相互制约作用可以稳定IFN-γ和IL-4的遗传表达，最终维持T细胞向Th1细胞的表型分化。原始CD4+T细胞分化的Th2细胞在IL-4/STAT6信号通路上进行转录，从而诱导Th2细胞分化的主要转录因子GATA-3在其上进行表达。GATA-3可结合Th1和Th2细胞因子基因的靶向调节序列，减少Th1表达和增加Th2表达。这就从基因层面诠释了Th1/Th2的平衡机制[9]。这可以说明转录因子GATA-3在Th1/Th2的平衡中起主要调节的作用，这就会引起Th2细胞明显增多，从而造成Th1/Th2 失衡，进而导致了哮喘的发生发展及病理性的改变。这项研究也进一步验证并完善了引起哮喘的免疫学机制是以Th2 细胞的相对增多所导致的Th1/Th2平衡失调。过敏性炎性疾病(如哮喘)的发生与年龄有关，而肠道微生物也会随着宿主年龄的增长而变化，这二者的相关性特征并非巧合[10]。有研究表明，由肠道菌群失调而导致的高水平血清炎性因子会增加哮喘患儿的发病率[11]。肠道菌群可以通过模式识别受体的作用以及其代谢产物的间接作用从而作用于肠道上皮细胞、树突细胞、T淋巴细胞等，使其共同参与免疫应答，并且诱导Th细胞向Th1方向分化，同时抑制Th2型炎性反应，来维持Th1/Th2的免疫平衡，从而缓解哮喘的进一步发展[12]。刘崇海[13]在其动物实验研究中用烟曲霉菌来诱导小鼠产生变应性反应，由此观察小鼠因抗生素所致的肠道菌群失调，以此观察变应性气道反应和肠道菌群失调之间的关系。实验研究证明，抗生素所导致的肠道菌群失调的小鼠通过烟曲霉菌变应原气道激活后，可以导致体内Th2 细胞因子增加，由此加重气道变应性反应，这项研究证明了抗生素导致的肠道微生物菌群失衡是哮喘等变应性疾病发生的相关诱因。在周围环境因素的刺激下，比如脆弱拟杆菌产生的多糖(PSA)，其Th0细胞逐渐向抗感染的Th1型免疫反应方向进行偏移，使体内Th1细胞增多，这就让Th1/Th2达到平衡，以防诱导变应性反应的发生与发展[14]。MOUSSU[15]在实验中给患哮喘小鼠口中含服双歧杆菌益生菌制剂，结果发现可以减轻小鼠的气道高反应，进一步研究发现，双歧杆菌益生菌制剂增强了小鼠的免疫耐受功能，下调了Th2，以此缓解变应性反应，从而提示菌群定植可以影响哮喘的发生，以及可以有效调节Th1/Th2的平衡，增强免疫耐受的作用。如果肠道微生物菌群平衡被破坏，造成菌群多样性或数量减少，那么机体会主导Th2表达，所以就会导致变态反应性疾病的发生。普通小鼠体内的IL-17以及IFN-γ等细胞因子与无菌小鼠相比，表达水平相对较高，而与之相对应的CD4+、CD25+、Foxp3+调节T细胞数量却明显减少。这表明，肠道微生物对机体内促炎症和抗炎症两种免疫反应之间的平衡有一定的影响[16]。

1.2 肠道微生物干预Th17/Treg免疫失衡早些研究已证实，在支气管哮喘发病中Th1/Th2细胞失衡起关键作用，但是随着医学的进步，一些研究表明，支气管哮喘的发病机制仅仅只用Th1/Th2细胞失衡学说来解释已经不够全面[17,18]。经典的Th1/Th2失衡学说不能一并概括哮喘的发病机制，且研究证实Th17/Treg的免疫失衡在支气管哮喘的发作中起到了关键的作用。Th17细胞可以通过分泌IL-17作用于嗜酸性粒细胞，从而促使嗜酸性粒细胞释放化学介质，增强炎症反应[19]。Treg细胞具有免疫抑制活性，可以分泌IL-10和TGF-β抑制T细胞增值及Th1和Th2的细胞因子反应。TGF-β又可以通过Smad7通路调节Foxp3转录因子增加Treg的表达。然而当存在感染时，致敏的树突状细胞等分泌IL-6与TGF-β协同作用于CD4+T细胞，使之朝向Th17方向分化，主导慢性炎症应答，其分泌的IL-17起到很强的促炎症反应，从而活化中性粒细胞并导致多种炎症因子的分泌，引起局部炎症，并且它还能作用于特定的细胞，使其放大或调节适应性免疫[20,21]。由于Treg细胞有免疫抑制活性，参与机体的免疫调节机制，所以Treg细胞可以通过负反馈调节T细胞活化所引起的免疫反应，研究发现在哮喘患者外周血中，Th17和IL-17显著增高，而Treg、IL-10则减少[22]。所以Th17/Treg及其分泌的最具有代表性细胞因子IL-17/IL-10之间的拮抗作用弥补了研究的缺憾。Th17/Treg的失衡以及肠道菌群的失调共同调控人体内炎症性疾病的发展和转归。肠道微生物参与这一机制主要是通过Th17细胞提供的通路来实现的。Th17细胞产生的细胞因子IL-17来源并非一处，例如回肠中的分节丝状菌(SFB)就可以诱导IL-17的产生[23]。而在哮喘发病过程中IL-17又是重要的细胞因子，它贯穿参与到哮喘发病中的气道炎症、气道阻塞、气道高反应性、气道重塑等方面[24]。Treg推动了肠道菌群与哮喘关系之间的研究进展, 在研究中发现肠道菌群定植是Th1和Treg 细胞随年龄逐渐成熟的主要驱动因素，而Treg细胞对抑制Th2细胞增多所产生的相关过敏反应有重要的作用，所以可以增加Treg细胞来发挥抗炎的作用[25]。尚有研究认为，肺-肠轴的内在联系主要是通过可迁移至其他黏膜组织(如支气管黏膜上皮)的Treg来完成的。然而这些关于“肺-肠-菌”轴的研究还停留在细菌分类标记水平，对微生物功能以及微生物与宿主的交互作用的研究有待完善。

2 益生菌在哮喘治疗中的应用

研究显示益生菌可以在肠道内定植,通过肺-肠轴影响肺部的微生物菌群,从而影响肺部的免疫功能,对哮喘有一定的治疗作用,可以成为治疗哮喘的潜在新药[26]。由此可见益生菌在哮喘的发展转归中有重要作用。目前已经有一些随机对照试验(RCT)研究发现益生菌制剂在改善哮喘临床症状以及减少药物服用方面有积极效果。鼠李糖乳杆菌是人体内正常菌群之一，具有肠道黏率高，定植力气强等作用，Vamshi Saliganti[27]利用瑞士白化小鼠研究鼠李糖乳杆菌MTCC5897对OVA所诱发小鼠过敏症的实验中发现，MTCC5897能够促进IL-4水平的降低和TGF-β水平的增加。然而益生菌在预防哮喘发病中的优势并非普遍，虽然益生菌能够预防人体患过敏性疾病，并且在治疗过敏性疾病中起到重要的作用，但是也存在着诸多问题。虽然大多数研究人员证实益生菌在治疗过敏性及炎症性疾病中发挥重大的作用，但也有一部分实验结果显示无效，例如有研究表明益生菌在改善成年人哮喘免疫失衡方面未见明显优势[28]。因此，益生菌治疗哮喘的方案仍需进一步明确研究。

由此可见，单纯的希望通过利用益生菌制剂调整肠道菌群来治愈哮喘并不现实，目前需要寻求一种既可以作用于哮喘免疫机制又能够激活微生物发挥免疫干预的药物来控制哮喘的发生和发展。近年来科学研究从中医“肺与大肠相表里”“培土生金”等理论中发现，在西医学中可以从呼吸道黏膜免疫与肠消化道黏膜的研究方向逐渐深入；组织学研究发现，呼吸系统的上皮及实质和消化系统肠道粘膜大多来自于原始消化管的内胚层，它们二者在动物胚胎时期属于同一个器官，由于在胚胎的逐渐发育过程中，才逐步分化成为消化系统与呼吸系统[29]。现代医学研究也证实了消化道和呼吸道粘膜是共同黏膜免疫系统的一部分。

3 黄芪干预哮喘的探究

有研究显示[30]黄芪在治疗哮喘上具有减轻气道炎症，调控气道重塑以及调节免疫功能上具有明确的疗效，且在“玉屏风散”“平喘固本汤”“六君子汤加味”等组方中都体现了中药黄芪的应用；且黄芪可以抑制Th2细胞增加，有效的调节Th1/Th2平衡，从而避免体内产生炎症性反应，研究发现黄芪可调节神经内分泌免疫[31]。因此，中药黄芪对肺-肠-菌轴的干预作用应当引起重视，以下从中药黄芪的主要成分进行探究。

3.1 黄芪甲苷(ASI)干预免疫调节中药黄芪的主要成分之一是黄芪甲苷(C41H68O14)。有实验研究显示[32]黄芪能够促使Th1中IFN-γ、IFN-β两因子的水平增高，从而提高对身体的保护能力，而Th1和Th2是能够调节细胞免疫和体液免疫的因子之一。由此可见，黄芪甲苷对由Th1/Th2失衡所引起的哮喘在平衡调节中起到重要作用。蔡萃等[33]利用ASI腹腔注射干预哮喘小鼠模型，观察了ASI对嗜酸性粒细胞(EOS)浸润的并对其中机理进行了分析，认为ASI能够减少EOS的浸润，降低GM-CSF、IL-5等细胞因子浓度，对eotaxin/CCR3介导哮喘通路有抑制作用，下调CCR3 mRNA的表达。IFN-γ可以使众多转录因子被激活，从而表达炎症介质，而ASI 能够通过抑制 STAT1/IκB/NF- κB信号通路的激活，降低炎症状态下小胶质细胞 IL- 1β、TNF- α和iNOS的基因表达，从而减少NO和TNF-α的生成和抑制IFN-γ诱导的小胶质细胞被激活[34]。然而，最新研究表明[35]ASI在体内的代谢需要经肠道微生物代谢，ASI经胃肠道吸收较差，口服无首过效应，其代谢途径主要是通过肠道微生物转化后发生糖基水解作用，其水解产物进入血液循环达到血药浓度后发挥药效作用。在中药方剂固本防哮饮中，研究发现方药中的黄芪成分ASI可以有效的缓解哮喘发病中气道阻塞感、呼气障碍，减轻呼吸道炎症，促进炎症细胞中抑炎因子IFN-γ的高分泌水平以减轻气道炎症的反应[36]。

3.2 黄芪多糖(APS)干预免疫调节黄芪的另一有效成分黄芪多糖对肠道微生物的构成则有重要调节作用。凌昊[37]研究表明APS能够抑制IL-4的产生及EOS的活化，减轻EOS浸润，促进Th0细胞向 Th1细胞分化，从而达到Th1/Th2平衡，抑制炎症因子的释放等；且可以降低气道高反应性。梁金花等[38]通过动物实验发现黄芪多糖可以促进大鼠体内双歧杆菌、乳酸杆菌的生长，降低肠球菌和肠杆菌在体内的含量。然而李树鹏等[39]用APS对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌3株致病菌进行体外干预，发现均有抑制作用，但APS对乳酸菌和芽孢杆菌也存在体外抑制作用，因而推断APS并非是简单的通过上调有益菌抑制致病菌而实现肠道菌群调节，其机制尚待研究。

4 讨论

综上所述，可提出研究假设：“肺-肠-菌”轴在哮喘发病机制中有重要作用。而中药黄芪及其有效成分黄芪甲苷、黄芪多糖，不仅可以直接参与机体免疫反应，而且可以间接通过调控肠内微生物干预哮喘发生的免疫机制。因此，探讨中药黄芪及其有效成分在哮喘治疗中的具体机理有利于该机制的进一步明确。目的在于证明黄芪通过调节肠道菌群恢复肺肠菌轴的功能最后起到治疗哮喘的作用。