新疆帕金森病患者PARK18基因rs3129882位点多态性与免疫球蛋白的相关性

乔 蕊,徐泽恒,孟新玲,夏 欢,杨新玲*

(1新疆医科大学第二附属医院神经内科,乌鲁木齐 830063;2新疆医科大学附属中医院脑病一科;3新疆医科大学第三附属医院核医学科;*通讯作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是第二常见且和年龄密切相关的神经系统变性疾病。全球有数百万人患病,60岁以上的人大约有1%的人受到该病的影响[1]。其中散发型帕金森病(sporadic Parkinson’s disease,SPD)占绝大多数,约占90%左右。近年来在PD患者脑组织活检中发现了活化的小胶质细胞、人类白细胞抗原(HLA)表达上调及炎性物质的增高等,均提示免疫炎症机制参与了PD的发病过程[2-5]。相关研究报道PARK18基因rs3129882是SPD的风险基因,其所在的HLA Ⅱ区单核苷酸多态性(single nuclear polymorphism,SNP)高度可变,存在民族及地区的差异[6-10]。rs3129882是PARK18基因的1号内含子,参与基因的表达调控,并且相关研究发现rs3129882作为顺式元件参与PARK18基因剪接,影响PARK18基因编码的蛋白形成及其抗原呈递从而参与帕金森病的发生[11]。免疫球蛋白的合成受遗传基因的调控,故基因的多态性可能影响免疫球蛋白的生成。故本课题组将研究PARK18基因rs3129882位点多态性与新疆地区SPD发病及免疫球蛋白水平的相关性。

1 对象及方法

1.1 研究对象

选取就诊于新疆医科大学第一附属医院、第二附属医院及附属中医院神经内科门诊及病房符合帕金森病诊断标准[12,13]的SPD患者193例,其中汉族SPD患者112例,维吾尔族SPD患者81例,男性SPD患者100例,女性SPD患者93例,平均年龄为(59.82±5.27)岁。同时选取体检中心进行体检的健康体检者232例作为对照组,其中汉族128例,维吾尔族104例,男性121例,女性111例,平均年龄为(59.69±5.12)岁。对照组与病例组在年龄、性别、民族方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象均签署知情同意书。

排除标准:①排除发热和血常规异常的感染者;②排除患有免疫系统疾病者;③排除近1个月内使用抗生素、激素和(或)应用非甾体类抗炎药及免疫抑制剂者;④排除近期外伤及手术的患者;⑤排除肝肾功能异常者、严重心脏疾病者及在3个月内接受过疫苗注射者;⑥排除恶性肿瘤或患有变性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 DNA的制备及引物的设计、合成 抽取2 ml外周静脉血置于抗凝管中,使用北京天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒,按照试剂盒配套说明操作书提取基因组DNA。在紫外线分光光度计上,以稀释DNA的缓冲液为对照测定基因组DNA在260 nm和280 nm处的吸光度(A)值,A260/A280为1.7-1.9,判为DNA纯度合格。样本-20 ℃保存,备用。引物设计参照文献[14]由上海生工公司合成。PARK18基因rs3129882位点:上游引物:5′-GAAGCAGGGGGACTATGACG-3′。下游引物:5′-TTATGTAGCCCTGCTGTGGT-3′。

1.2.2 目的基因PCR及测序 反应体系共30 μl：10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,TaKaRa TaqTMPolymerase(5 U/ml)0.3 μl,DNA模板1 μl,加水补至30 μl。整个PCR扩增反应在Verity 96well PCR仪(美国ABI公司)中进行。反应条件:95 ℃ 5 min;15个循环×(95 ℃ 30 s,65-50 ℃(-1 ℃/循环)30 s,72 ℃ 60 s);20个循环×(95 ℃ 30 s,退火温度52 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s);4 ℃保存,PCR产物为232 bp。所得PCR产物加样10 μl于2%琼脂糖凝胶中,以120 V电泳40 min,于紫外线凝胶成像仪下观察,确定所得产物为研究所需片段。取10 μl PCR扩增产物送上海生工生物公司直接测序以确定DNA序列。PARK18基因rs3129882位点分析结果与既往国内外相同研究一致,SPD组及对照组均存在AA、AG、GG三种基因型。

1.2.3 血清免疫球蛋白的检测 取清晨空腹静脉血2 ml置于真空促凝管,2 h内,4 ℃、4 000 r/min,离心5 min,取血清。使用美国贝克曼库尔特特种蛋白分析仪采用免疫比浊法检测血清中IgG、IgA、IgM水平,机器型号:IMMAGE800,试剂盒:美国贝克曼库尔特免疫球蛋白G检测试剂盒、免疫球蛋白A检测试剂盒、免疫球蛋白M检测试剂盒。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验

病例组(P=0.358)和对照组(P=0.564)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05),表示两组均有良好的群体代表性。

2.2 部分测序峰图

病例组和对照组rs3129882位点测序均发现存在AA型(野生型)、AG型(杂合突变型)、GG型(纯合突变型)三种基因型(见图1)。

2.3 两组rs3129882基因型和等位基因分布的比较

病例组与对照组PARK18基因rs3129882基因型和等位基因分布的比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

图1 rs3129882位点测序图Figure 1 Sequencing of rs3129882 site

表1SPD组与对照组rs3129882基因型和等位基因频率分布比较例(%)

Table1Comparisonofrs3129882genotypeandallelefrequenciesindifferentgroupscases(%)

组别n基因型频率GGAGAAχ2P等位基因频率GAχ2P病例组19377(39.9)85(44.0)31(16.1)0.1280.938239(61.9)147(38.1)0.0450.832对照组23289(38.4)106(45.7)37(15.9)284(61.2)180(38.8)

2.4 不同分层rs3129882基因型频率及等位基因比较

按民族分层分析,维吾尔族SPD病例组和对照组rs3129882基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.942,P=0.624),等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2=0.017,P=0.895);汉族SPD病例组和对照组rs3129882基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.242,P=0.886),等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2=0.027,P=0.870)。按性别分层分析,男性SPD病例组和对照组rs3129882基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.269,P=0.874),等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2=0.158,P=0.691);女性SPD病例组和对照组rs3129882基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.590,P=0.745),等位基因分布比较差异无统计学意义(χ2=2.118,P=0.146)。

2.5 三种基因型间IgG、IgA、IgM比较

对于SPD病例组,三种基因型间IgG(F=0.533,P=0.588)、IgA(F=1.299,P=0.275)、IgM(F=0.799,P=0.451)含量比较差异无统计学意义;对于对照组,三种基因型间IgG(F=0.341,P=0.712)、IgA(F=0.449,P=0.639)、IgM(F=0.727,P=0.484)含量比较差异无统计学意义。

2.6 不同分层三种基因型间IgG、IgA、IgM比较

按民族分层分析,对于SPD病例组,汉族和维吾尔族三种基因型间IgG、IgA、IgM含量比较差异无统计学意义(P>0.05,见表2);对于对照组,汉族和维吾尔族三种基因间IgG、IgA、IgM含量比较差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

分组民族基因型nIgGIgAIgM病例组汉族GG4410.55±1.602.49±0.760.79±0.18AG5110.45±1.742.71±0.690.80±0.17AA1711.00±0.962.40±0.780.83±0.20F0.7671.6020.329P0.4670.2060.720维吾尔族GG3311.69±0.962.59±0.531.24±0.62AG3411.87±0.942.41±0.481.11±0.43AA1411.73±1.202.33±0.251.25±0.60F0.2961.9840.590P0.7450.1440.557对照组汉族GG51 9.78±1.502.63±0.850.91±0.45AG55 9.53±2.092.59±0.780.99±0.56AA22 9.86±1.492.76±0.901.02±0.46F0.3980.3110.499P0.6730.7330.608维吾尔族GG3810.72±1.801.89±0.741.35±0.77AG5110.52±1.481.79±0.791.44±0.61AA1510.08±1.901.70±0.681.30±0.71F0.7930.4070.321P0.4550.6670.726

按性别分层分析,对于SPD病例组,男性和女性三种基因间IgG、IgA、IgM含量比较差异均无统计学意义(P>0.05,见表3);对于对照组,男性和女性三种基因型间IgG、IgA、IgM含量比较差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

分组性别基因型nIgGIgAIgM病例组男GG4011.14±1.292.46±0.570.91±0.39AG4611.15±1.712.58±0.660.95±0.34AA1411.06±0.932.42±0.590.97±0.39F0.0220.6180.185P0.9790.5410.831女GG3710.94±1.662.62±0.771.06±0.56AG3910.87±1.522.59±0.600.89±0.34AA1711.56±1.232.33±0.621.06±0.53F1.2861.1251.563P0.2820.3290.215对照组男GG4710.15±1.822.35±0.880.99±0.50AG5410.21±1.942.25±0.931.22±0.60AA2010.03±1.692.43±1.091.10±0.50F0.0710.3152.099P0.9310.7300.127女GG4210.22±1.56 2.28±0.891.22±0.76AG529.79±1.812.16±0.821.20±0.66AA179.85±1.642.20±0.811.18±0.68F0.7990.2180.021P0.4530.8040.979

3 讨论

PD最早是在1817年由Parkinson医生提出的,临床上主要以静止性震颤、肌肉僵直、运动弛缓的典型运动症状为主。尽管从PD第一次被提出到现在已200余年,但目前该病的病因及发病机制尚不明确,除此之外疾病的诊断及治疗也十分有限。因此亟需加深对疾病的研究,明确病因、机制,找到有效的诊断及治疗方法。免疫机制和PD的关系是由Abramsky等[15]首先提出的,近年来越来越多的研究成果也证实了这个观点。探讨PARK18基因rs3129882位点多态性与新疆SPD及免疫球蛋白的关系,这对SPD的早期诊断、治疗具有重要的临床价值。

3.1 两组研究对象PARK18基因rs3129882位点多态性比较

在最近的全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)中PARK18基因被定义为散发型帕金森病的风险基因[14]。rs3129882被认为是与PD相关性最强的非编码多态性位点,其通过免疫机制增加了SPD发生的风险。PARK18基因rs3129882位点多态性与SPD的关系最早是在白种人中发现的[14],在该项研究中作者发现rs3129882(A/G)的G等位基因与美国人患帕金森病的风险增加有关,并强调了该位点与帕金森病及人类免疫的关系。Jamshidi等[16]研究发现rs3129882的等位基因频率在伊朗帕金森病患者和对照组之间存在显著的差异,从而推测出rs3129882的多态性可能是伊朗人PD的一个风险因素。田锦勇[17]通过对中国汉族SPD患者及对照组的PARK16-18基因位点进行分析,发现rs3129882位点所有基因型中,SPD组A等位基因频率高于对照组,且差异有统计学意义,另外对该位点基因型按年龄和性别进行分层分析时发现AA基因型多见于男性,且具有统计学意义。但Ma等[18]在包括中国、新加坡和马来西亚在内的帕金森病病例对照研究的荟萃分析中发现rs3129882等位基因型分布在病例组与对照组之间没有显著差异,从而推测出PARK18基因rs3129882 A/G多态性和中国帕金森病患者无关,这和本文研究结果一致。近年来有关PARK18基因rs3129882位点多态性与SPD关系的研究逐年增加,但结果不尽相同,可能与PARK18基因rs3129882是一组免疫应答基因,具有高度多态性,存在民族及地区差异有关。此外SPD的发生不是单一因素的作用而是包括基因-环境因素在内多种因素共同作用的结果。本文研究结果暂不能证明PARK18基因rs3129882位点多态性与新疆地区SPD患者发病相关,除了上述提到的两种因素外,还可能与样本量相对不足有关,但不能就此排除该基因多态性参与SPD发病可能。因此PARK18基因rs3129882位点多态性在不同地区、不同人群中是否为SPD发病的危险因素还需深入研究。

3.2 PARK18基因rs3129882位点多态性和免疫球蛋白之间的关系

不同的抗原分子的特殊表位被不同的HLA Ⅱ类基因产物识别,进而刺激机体产生不同免疫应答。HLA特殊类型的存在可能使机体对某些抗原产生高免疫球蛋白[19,20]。免疫球蛋白的合成受遗传基因的控制,故PARK18基因rs3129882位点多态性可能使机体对某些抗原产生过高的免疫球蛋白。谢庆玲等[21]通过分析HLA基因多态性与支气管哮喘儿童IgE水平关系的研究发现HLA-DRB1*160XX和HLA-DRB1*3(17)等位基因与哮喘儿童的血清IgE水平相关,且HLA-DRB1*160XX可能是高水平血清IgE的抗性基因。季伟等[22]研究发现毛细支气管炎患儿外周血淋巴细胞HLA-DR表达阳性率显著高于对照组,并与血清IgE水平呈显著的正相关。于立杰等[23]研究发现HLA-DRB1*03基因与IgG4相关疾病易感有关。除此之外,其他疾病如浸润型肺结核、Graves眼病、慢性荨麻疹等研究证实了HLA Ⅱ类基因多态性与免疫球蛋白之间有一定的相关性。本研究结果表明SPD患者PARK18基因rs3129882位点多态性和IgG、IgA、IgM水平无关,但因目前国内外尚无相关研究涉及PARK18基因rs3129882位点多态性与免疫球蛋白之间的关系,故需反复研究明确两者之间的关系。