miR-432在神经胶质瘤中的表达及作用

邓红艳 王丽颖 刘红军

神经胶质瘤(简称为胶质瘤)是一种发生在神经外胚层的恶性肿瘤，是神经系统肿瘤中发病率较高的恶性肿瘤之一，占30%左右[1,2]。胶质瘤具有生长速度较快、治愈率低、术后复发率较高、存活率低、预后较差等特点，患者通常出现颅内压增高、癫痫、呕吐等临床症状，严重影响患者的生活质量和生命安全[3,4]。因此，胶质瘤已成为临床和基础研究的重点问题[5]。

MicroRNA(miRNA)是一种广泛存在于真核生物、长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，其本身并不能翻译蛋白质，而是通过与mRNA的3’端非翻译区的碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达[6,7]。近年来，有研究报道miRNAs能够参与细胞分化、增殖、衰老、凋亡等生物学过程，并能够在肿瘤等疾病的发生发展过程中发挥重要调控作用[8,9]。本文主要研究miR-432在神经胶质瘤患者中的表达及临床意义，为今后神经胶质瘤的治疗提供实验基础和理论依据。

1.资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年1月至2018年1月我院收治的胶质瘤患者的脑组织15例，并收集同期在我院接受治疗的创伤性脑损伤患者脑组织15例作为正常对照组。胶质瘤患者年龄范围为10～75岁，平均年龄为(42.5±26.75)岁，其中男性8例，女性7例，根据《WHO中枢神经系统肿瘤分类》分期标准：Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例，Ⅳ期8例。对照组患者年龄范围为10～75岁，平均年龄为(41.75±27.05)岁，其中男性8例，女性7例。两组患者在年龄、性别比较差异无统计学意义，具有可比性。

所有标本病理结果均经病理科及2名医师证实，采集样本前患者均未接受任何放疗、化疗等辅助治疗。本研究经过我院伦理委员会批准，所有患者及家属自愿签署知情同意书。标本采集后立即置于液氮或-80℃冰箱保存。

1.2 细胞培养和转染 胶质瘤细胞系U87细胞购于南京科佰生物科技有限公司(中国)。U87细胞采用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物的DMEM培养液(Hyclone公司，美国)，并置于37℃、5% CO2培养箱(Thermo公司，美国)中培养。当细胞汇合度达到50%～60%时，采用转染试剂Lipo2000(Invitrogen，美国)进行细胞转染。细胞分组分为miR-432过表达组(miR-432mimic组)、miR-432敲减组(miR-432inhibitor组)、miR-432过表达阴性对照组(mimic-NC)、miR-432敲减阴性对照组(inhibitor-NC)。使得miR-432mimic和mimic-NC终浓度为50nM，miR-432inhibitor和inhibitor-NC终浓度为100nM。细胞转染24小时后进行后续实验。

1.3 RNA提取和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR) 根据Trizol Reagent试剂(Invitrogen，美国)说明书提取组织、血清和细胞中总RNA，并使用NanoDrop2000检测RNA浓度和纯度。按照逆转录试剂盒(ABI，美国)说明书进行逆转录反应，将RNA逆转录为cDNA。根据SYBR Green PCR Master Mix(罗氏，中国)说明书进行qRT-PCR实验。反应条件如下：先95℃预变性10分钟后，95℃变性15 秒，60℃退火60秒，完成40个循环，进入熔解程序：95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒，最后72℃延伸10 分钟，置4℃保存。以U6为内参基因，检测miR-432的表达水平。所有引物均购于吉玛公司(中国)。

1.4 CCK-8实验 采用CCK-8实验检测细胞活力。首先，将细胞以1×104个细胞/孔密度接种于96孔板中，细胞转染24小时后，在每孔中加入10μL CCK-8溶液(北京百奥莱博，中国)，孵育4小时。采用酶标仪检测450nm处的吸光度。每组设置6个复孔取平均值，另设单孔只加入培养基作为空白对照。

1.5 细胞划痕实验 采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。首先，将细胞接种于六孔板中，细胞转染24小时后，利用一次性进口吸头在每孔中竖直划一条直线，用PBS(索莱宝，中国)清洗细胞，以去掉漂浮的细胞，然后更换新鲜培养液继续培养。分别于0小时、24小时后观镜下观察并拍照，对比不同时间细胞划痕宽度。

1.6 统计学方法 所有数据均表示为均数±标准差，用graphpad软件对所有数据进行统计学处理。计量资料行t值检验，计数资料行卡方检验，组间差异经P进行判定，当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 胶质瘤患者中miR-432的表达 qRT-PCR实验结果显示，与非胶质瘤患者的脑组织相比，胶质瘤患者癌症组织中miR-432的表达显著降低，差异具有统计学意义(P=0.0019)，见图1A。此外，检测胶质瘤患者和非胶质瘤患者血清中miR-432的表达，结果显示与非胶质瘤患者相比，胶质瘤患者血清中miR-432的表达显著降低，差异具有统计学意义(P=0.0228)，见图1B。

2.2 细胞转染后miR-432的表达量变化 与mimic-NC组比较，细胞转染miR-432的类似物，即miR-432mimic后，miR-432的表达量显著升高(P=0.0018)，见图2A。与inhibitor-NC组比较，细胞转染miR-432抑制剂，即miR-432inhibitor后，miR-432的表达量显著降低(P=0.0161)，见图2B。

图1

图2

2.3 miR-432对胶质瘤细胞活力和迁移能力的影响 CCK-8实验结果显示，与mimic-NC组相比，miR-432mimic显著降低胶质瘤细胞系U87细胞的活力，而与inhibitor-NC组相比，miR-432inhibitor显著升高U87细胞活力，见图3A。细胞划痕实验表明，与mimic-NC组相比，miR-432mimic显著降低胶质瘤细胞系U87细胞的迁移能力，而与inhibitor-NC组相比，miR-432inhibitor显著升高U87细胞的迁移能力，见图3B。

图3

3.讨论

神经胶质瘤的发生发展是一个复杂的多因素多阶段病理生理过程[10,11]。有研究表明，miR-432能够参与细胞增殖、分化、凋亡等，进而调节心肌肥厚、胰岛素敏感性、肥胖、炎症、肌生成等[12～16]。Jiale Zhang等人通过基因芯片技术发现miR-432在人胶质瘤组织中的表达显著降低[17]。然而，miR-432与胶质瘤的关系尚不明确，因此本研究应用qRT-PCR技术检测miR-432在15例胶质瘤患者的癌症组织和15例非胶质瘤患者的脑组织中的表达情况。结果显示，miR-432在胶质瘤组织中的表达显著降低。qRT-PCR实验结果提示，miR-432在胶质瘤患者血清中miR-432的表达水平显著低于非胶质瘤患者。有研究证实，miR-432与肝细胞性肝癌、乳腺癌、前列腺癌等人类癌症密切相关[18～20]，然而鲜见报道miR-432与胶质瘤存在相关性。本研究通过向胶质瘤细胞系U87细胞分别转染miR-432类似物或抑制剂，构建miR-432过表达细胞和敲减细胞，进行CCK-8实验和细胞划痕实验，检测miR-432类似物或抑制剂对胶质瘤细胞活力和迁移能力的影响。CCK-8结果表明，miR-432过表达组细胞活力低于阴性对照组，而miR-432敲减组细胞活力高于阴性对照组。细胞划痕实验表明，与阴性对照组细胞相比，miR-432过表达组细胞迁移能力显著降低，而miR-432敲减组细胞迁移能力显著升高。

综上所述，miR-432在胶质瘤患者癌症组织和血清中表达均显著降低，并在神经胶质瘤细胞U87中发挥抑癌作用，我们认为miR-432可以作为临床诊断、预测、治疗神经胶质瘤的重要标记物。我们将在后续的研究中探究miR-432抑制胶质瘤细胞的活力和迁移能力的分子机制，为临床治疗脑胶质瘤提供有价值的依据。