病毒基因工程药物研究进展

李远远，王鋆坦，李彩霞，徐钟

(河南省科学院商业科学研究所，郑州 450002 )

用活体微生物药物治疗细菌感染源于20世纪早期，微生物学家Felix d’Herelle利用噬菌体治愈痢疾，并开发出针对不同疾病的噬菌体载体药物[1,2]，但噬菌体疗法并不稳定，其光芒被随后发现的第一种抗生素类药物青霉素所掩盖。与噬菌体药物相比，抗生素类药物性质稳定便于储存和运输、抗菌谱广、免疫原性弱，具有更高的开发价值。近年来，随着抗生素的广泛使用，病原菌对抗生素的耐药性越来越强，而新抗生素的发现变缓，亟需开发出替代抗生素治疗的方案。病毒基因工程药物最大的优势是能够自我繁殖，可以达到持续用药的效果，以病毒为载体，通过对其效应物表达的调控，可以控制其给药时间、部位及用药量，实现精准用药，减少药物对正常细胞的毒副作用。我们将在本文中介绍以病毒为治疗载体的药物研究进展，比较不同病毒的特点，效应物分子的表达调控以及在疾病治疗中的应用。

1 病毒载体药物

病毒通过将遗传信息整合到宿主细胞的基因组中，利用宿主细胞的复制和表达系统合成自身原件并杀死宿主。一些病毒具有肿瘤选择性，例如M1病毒、细小病毒、牛痘病毒等，将这些病毒进行遗传改造，以提高他们对癌症细胞的选择性和减少对正常细胞的毒性，用于肿瘤治疗。以细菌为食的病毒被称为噬菌体，噬菌体具有较强宿主选择性，一种噬菌体能选择性的消灭特定致病菌，一般采用裂解性噬菌体用于治疗细菌感染，目前随着多重抗生素耐药超级细菌的出现，噬菌体疗法越来越受关注。

1.1 噬菌体载体药物

利用裂解性噬菌体对抗细菌感染源于Felix d’Herelle的研究，与抗生素不同，噬菌体种类繁多，病原菌对一种噬菌体产生抗性后能很快找到替代者。噬菌体疗法在波兰有较长的历史，对该国的噬菌体疗法评估结果显示，153名携带耐药性致病菌的患者中，40%患者症状得到改善，18%患者达到临床康复标准[3]。在俄国，噬菌体疗法是一种常规治疗手段，各药店都有Microgen制药公司生产的各种抗感染的噬菌体非处方药物出售[2]。自抗生素发现后，欧美国家放弃噬菌体疗法，目前，随着全球性的抗生素耐药菌日趋严重，西方国家正加大噬菌体疗法研究的投入，例如欧盟于2013年成立Phagoburn项目，开发治疗烧伤的噬菌体疗法[4]。

噬菌体是自然界中种类最多的生物体，从宿主菌丰富的环境中可以分离出各种对该细菌具有侵染作用的噬菌体[5,6]。但并非所有这些噬菌体都适于开发活体药物，作为治疗药物的噬菌体需具备快速杀死宿主菌的能力，能够侵染致病菌的各变异亚种，具有稳定的基因组，能快速繁殖，对pH变化稳定，易于包装和长期储存，不引起自身免疫反应等[7]。此外，由于噬菌体识别的细菌表面受体不同，一些噬菌体能够侵染多种细菌(广谱)，一些噬菌体只对特定的细菌具有杀灭作用(专一)，在感染病原菌的治疗前，专一性噬菌体药物的开发可采用逐步筛选的方法，以对一种噬菌体产生抗性的菌株为靶标，筛选出能侵染该菌株的新噬菌体，循环筛选，直到最后一轮产生的噬菌体抗性菌株对最初的噬菌体敏感，将这些噬菌体制成混合噬菌体药物，用于治疗耐多种噬菌体药物的细菌感染[8]。

利用现代生物技术能够快速鉴别和筛选出适于临床治疗的噬菌体。其中一种方法是用电子显微镜观察噬菌体的形态，鉴别噬菌体种类，选取烈性噬菌体作为候选药物，该方法同时可用于检测噬菌体储存药物的质量[7]。另一种方法是基因组测序，通过噬菌体功能基因组分析，选择适于疾病治疗的噬菌体，能高效感染宿主菌的噬菌体有以下特点：1. 表达DNA依赖的RNA聚合酶，能快速复制，并抑制宿主菌的转录；2. 具有相对简单的结构，不形成溶原状态；3. 不含有基因整合酶和转录阻遏蛋白，为烈性噬菌体；4. 表达裂解酶和聚合物解聚酶，能有效识别和裂解宿主细胞[7]。

噬菌体进入人体后，会被体内天然和获得性的免疫反应消除，这是影响噬菌体疗法疗效最主要的因素。有研究表明无论何种给药方式，噬菌体都能进入人体循环系统，同时会降低人体对病原菌的天然免疫防御[9,10]，因此，每种用于免疫治疗的噬菌体都需要进行免疫反应测试。为提高噬菌体疗法的抗菌活性，用于临床治疗的每剂噬菌体药物都含有多种噬菌体。此外，噬菌体的繁殖需要时间，在传染性病原菌爆发时期，噬菌体疗法的效果不显著，需要以抗生素治疗为主[11]。

为提高噬菌体药物的药效，通过分子生物学手段加强噬菌体对病原菌的裂解效果。噬菌体会产生促进细胞裂解的蛋白质，例如抑制肽聚糖合成的Amurins，降解肽聚糖的Endolysins和孔道蛋白Holins[12]，让噬菌体携带外源裂解酶(例如Gp17和PlySs2)，以增强其的杀菌效果[13]。让噬菌体携带感光剂tin(IV) chlorin e6 (SnCe6)，在红光激发下杀灭靶细菌[14]。采用脂质体包埋的方法增长噬菌体在体内的半衰期，保证噬菌体到达病灶部位[15]。噬菌体对宿主具有较强选择性，因此常规噬菌体疗法对一些病人无效，为此Eliava研究所推出了个性化治疗方案，用患者的病原菌，从噬菌体库中筛选针对该病原菌的噬菌体药物[16]，由于制备周期长，该药物适用于慢性疾病(例如慢性胃肠疾病)的治疗。针对耐药性的病原菌，采用携带CRISPR/Cas基因编辑系统的噬菌体，对耐药菌的抗性基因进行剪切，达到定向杀灭耐药菌的目的[17,18]。细菌耐药基因一般是质粒携带的，采用质粒依赖性的噬菌体，例如噬菌体PRD1，特异性的杀灭耐药性的大肠埃希菌和沙门菌[19]。噬菌体与抗生素联合用药，能增强杀菌效果，例如噬菌体SBW25F2与卡那霉素联合使用，能降低荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)耐药性的出现[20]。

1.2 人源病毒载体药物

病毒通过识别靶细胞表面受体进入细胞，选择能进入特定人体细胞和组织的病毒作为载体，携带用于疾病治疗的基因，能达到靶向治疗的目的。目前，具有作为疾病治疗的病毒载体有腺病毒相关病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒、和豆病毒。

腺病毒相关病毒(AAV)属于细小病毒科，需要借助辅助病毒(如腺病毒)完成复制。AAV是一种人类自身携带的非致病性病毒，不会对人体产生免疫反应[22]，因此可以直接用于体内细胞侵染，在细胞中可以以游离的形式存在，但具有较长的外源基因表达周期，通过AAV瞬时表达外源基因，是目前基因治疗的标准方法。AAV最大的载容量为3kb，能够浸染多种细胞和组织[21]。基于AAV载体的基因治疗已经进入临床应用。例如：世界上首个基因治疗药物阿利泼金(Glybera)，是由AAV1携带人源脂蛋白脂肪酶基因，通过肌肉注射治疗脂蛋白脂肪酶缺乏遗传病[23]，是目前最昂贵的药物。由AAV2携带 RPE65(视网膜发色团异构酶)基因用于治疗Ⅱ型先天黑蒙症(LCA2)[24]，已经进入三期临床试验阶段。此外，基于AAV治疗血友病B、内风湿性关节炎、囊性纤维症、无脉络膜、肌肉萎缩、抗胰蛋白酶缺乏症、重度心力衰竭和帕金森等疾病的基因药物已经进入临床试验阶段[25]。

慢病毒是一类潜伏期长的反转录病毒，具有较大的外源基因容量(18kb)，被广泛用于基因治疗。慢病毒载体在基因组上的整合位点相对随机，较倾向于转录活跃区域，但病毒基因在基因组上的整合会引起甲基化或表观遗传修饰，因此外源基因的表达水平差别较大[26,27]。慢病毒载体常用于体外侵染细胞然后再植入体内，可用于造血细胞的转导[25]。基于慢病毒载体的基因治疗正进入临床试验，例如：携带β-球蛋白基因的慢病毒载体，用于治疗β-地中海贫血症[28]；携带脂肪酸转运子编码基因abcd1的慢病毒载体，用于治疗X染色体连锁的肾上腺脑白质营养不良(ALD)[29]；以及用携带效应基因的慢病毒载体治疗慢性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和异染性脑白质营养不良等疾病[25]。

牛痘病毒载体具有较大的外源DNA容量，且无须整合到宿主基因组中，能通过血管传播，因此能用于转移性肿瘤的治疗。携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-GSF)的牛痘病毒载体，对黑色素瘤、肝癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、甲状腺癌、胰腺癌和胃癌都具有疗效[30,31]。利用只能在癌症细胞中繁殖的人工牛痘病毒载体，携带黑色素合成基因-酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白合成基因，用于癌症治疗。被该病毒侵染的癌细胞将表达黑色素，利用黑色吸热原理，用激光对肿瘤进行温热治疗[32]。

腺病毒是双链DNA病毒，宿主范围广，转化效率高，且具有较大外源DNA容量，无须整合到宿主基因组中。但腺病毒具有较强免疫原性，能引起宿主较强的免疫应答反应，因此主要用作疫苗载体，例如：携带H5N1和H1N1抗原的腺病毒载体，口服用于预防H5N1和H1N1型流感病毒，临床试验结果显示具有疗效[33]。

2 病毒载体药物的表达系统

微生物工程菌株应用于疾病治疗时，其效应物分子表达的时间、空间和表达水平决定了该药物的疗效。例如，为增强病毒对肿瘤细胞的侵染效率，在病毒的外壳上表达能与肿瘤细胞结合的抗体亚基Fab或其它能与肿瘤细胞结合的多肽，保证病毒在肿瘤细胞中的富集，同时采用肿瘤或癌细胞特异的启动子(端粒酶反转录酶启动子hTERT，低氧诱导启动子E2F-1和α-甲胎蛋白AFP启动子等)调控效应物分子表达，保证药物分子只在肿瘤细胞中表达[34]。为维持细胞内药物与底物的平衡，采用底物诱导型启动子调控效应物分子表达，例如用人工合成的脂肪酸诱导启动子PPARα-TtgR表达减肥药普兰林肽，用于肥胖病的治疗[35]。

为保证药物分子能持续发挥疗效，构建具有信号储存能力的工程菌，可以在疾病信号分子瞬时表达过后，仍能起到持续治疗作用。例如，采用噬菌体的位点特异性整合系统，该系统被信号分子触发后，在基因特定位点发生重组，进而改变效应物调控系统的结构，达到组成型表达效应物分子的目的[36]，此外，还可以采用转录调控系统储存信号，当效应物分子被触发表达后，没有诱导物的情况下也能持续表达[36]。为避免人体对外源效应物的免疫排斥，采用RNA等非蛋白类物质为效应物用于基因治疗[37]。

3 结论与展望

天然病毒对其靶细胞具有杀灭作用，但作用强度及时效性无法控制，使其医用价值受限。根据病毒对靶细胞的选择性，以及病毒能作为DNA载体将外源基因转移到宿主细胞中的特性，选择特殊的病毒作为外源治疗基因的载体，将具有疾病治疗作用的分子导入特定的组织、细胞或细菌中表达，能达到靶向治疗或定向杀菌的效果。该技术不仅可以用于遗传疾病的基因治疗，还能用于开发替代传统化学药物的活体微生物药物，对医药发展具有重要的推动作用。

随着新一代测序技术的快速发展，测序效率不断提高以及测序成本的不断下降，使得通过全基因组测序分析患者的基因缺陷成为可能，也为个性化基因治疗奠定了基础。但是出于安全性考虑和其天价的治疗费用，目前大部分基因治疗都处于动物试验阶段。全球首个基于AAV的基因治疗药物Glybera(治疗脂蛋白脂酶缺陷症)在欧盟上市3年后，出于成本的考虑于2017年10月退出市场[38]。2016年5月全球第二个基因治疗药物Strimvelis(治疗腺苷脱氨酶ADA缺乏性重度免疫缺陷症)在欧洲上市，Strimvelis基因治疗，通过逆转录病毒(retrovirus)在体外将一个正常的ADA基因拷贝导入患者干细胞中，然后将修饰后的干细胞定植到患者骨髓，达到一次治疗终生治愈的目的，极大的降低了治疗费用[38]，尽管如此，但65万美元的治疗费用一般患者无法承担。目前，热门的新型生物技术CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法与Glybera疗法类似，通过体外改造人体T细胞，让其携带识别特定肿瘤抗原的嵌合抗原受体基因，然后将修饰后的T细胞导入患者体内，用于白血病和肿瘤的治疗[39]，由于CAR-T疗法具有更广的患者群体，其价格稍低于Glybera疗法。目前有两款CAR-T产品被美国FDA批准上市，Kymriah(2017年8月)用于治疗急性淋巴细胞白血病和慢性大B细胞淋巴瘤，Yescarta(2017年10月)用于治疗大B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，此外还有大量CAR-T产品处于临床前试验阶段[39]。我国CAR-T产业发展迅速，自2017年12月起南京传奇、上海明聚生物和上海恒润达生等多家企业陆续申报了CAR-T 细胞临床试验。 2015年至今，我国CAR-T疗法专利呈直线增长[40]。但目前CAR-T疗法副作用明显，国内外均出现多起CAR-T致死案例，因此CAR-T细胞构建方法及抗原靶点的选择有待进一步优化，病毒基因载体技术的发展是其重要环节。

传统化学药物在人类的健康及农业发展史上具有重要作用，但是随着化学农药和抗生素的广泛使用，农药污染和抗生素耐药性问题越来越突出，病虫害的生物防治和抗生素替代疗法逐渐受到重视。2015年美国开始采取抗生素替代计划，逐步减少抗生素的使用，其中重要的举措就是批准噬菌体制剂在食品和饲料添加剂中使用[41]，同时，国外许多药企开始聚焦噬菌体疗法的研发和推广，例如：以色列一家微生物菌群治疗公司BiomX2017年融资2400万美元，开发定制的噬菌体疗法用于根除痤疮和炎症性肠病相关的有害细菌；美国两家初创公司AmpliPhi生命科技公司和Adpitive Phage治疗公司都致力于开发代替抗生素治疗的实用噬菌体治疗方案。我国是抗生素滥用最为严重的国家之一，2016年国家开始实施细菌耐药国家行动计划(2016—2020)，逐步淘汰抗生素在饲料添加剂中的使用。近年来，噬菌体疗法的研究发展迅猛，国内相继成立了“国际噬菌体研究中心”(2014年11月)，“上海噬菌体与耐药研究所”(2017年8月)，“国际噬菌体药物研究中心”(2017年10月)，和“中英噬菌体合作研发实验室”(2018年8月)。与西方国家相比，我国缺少参与噬菌体疗法研究的大型药企，这些大型药企在噬菌体疗法中的创新研究将极大推动我国噬菌体疗法的发展。