药食同源果树欧李分子水平研究进展

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(1. 山西农业大学,山西 太谷 030801；2. 晋中学院,山西 榆次 030019)

药食同源植物是经过多年、甚至数百年数千年食用而被证实对人体有益无害，适合普通人群长期食用的物种。《本草纲目》中记载的药食同源果树有乌梅、桑葚、沙棘、橘、杏仁、桃仁、酸枣仁、枣、荔枝、郁李仁等。欧李仁在传统中药中一直作为郁李仁的种仁出现，含苦杏仁甙(amygdalin)、脂肪油、皂甙等；性平，味辛、苦、甘；润肠通便，利水消肿，用于肠燥便秘，小便不利，腹满喘促，脚气，浮肿。欧李的果实可食用，营养丰富 ，其含营养种类之多，含量之高，优于樱桃、李、杏、桃等核桃类果品。其中维生素VA、VB2、VB12、VC、VE；微量元素含量丰富，果肉中钙含量达524 mg/kg，鲜种种仁钙含量达3 743 mg/kg[1,2]；含有包括赖氨酸在内的19种氨基酸、多肽、不饱和脂肪酸、γ-氨基丁酸和神经酸等；果实中多酚类物质含量丰富，包括单宁类、酮类、花色苷及酚酸类等等，因此欧李具有很强的抗氧化活性及清除自由基的能力，有很好的保健价值。目前，通过人工驯化已培育出‘农大3号’‘农大4号’‘农大5号’‘农大6号’‘农大7号’‘燕山1号’‘京欧1号’‘蒙原早丰’‘蒙原早红’等鲜食和加工品种。随着生活质量的提高人们已不再满足“有病能治好”，更多希望“根本不得病”，与大宗水果相比更青睐于药食同源果品，因此欧李的应用前景广阔。

1 欧李的研究现状

1.1 主要研究方向

通过对281篇发表的文献和硕士、博士论文的阅读分析和实践调查，可知学术工作者和生产实践者从形态到功能、从栽培到采后、从品质到代谢、从生态到发展、从遗传到分子水平对欧李进行了研究。概括出目前对欧李的研究主要集中在以下方面：1)欧李的形态特征，2)欧李的生物学特性，3)欧李的抗性研究，4)欧李的生态适应性和生态学效应，5)欧李的栽培与育种，6)欧李果实品质及抗氧活性研究，7)欧李的营养成分分析，8)欧李内含物的提取条件，9)欧李快繁技术，10)外源物质对欧李代谢的影响，11)欧李推广的可行性分析与对策，12)欧李采后贮藏与加工，13)欧李遗传变异分析，14)欧李基因型鉴定，15)欧李基因检测与功能表达，16)欧李酶活性研究，17)欧李多肽的制备及活性研究，18)欧李可持续发展研究。

1.2 基因克隆方面

目前对欧李基因的克隆主要有线粒体基因、叶绿体基因和核基因，这些基因涉及到物质代谢和能量代谢基因、通道蛋白基因、自交不亲和基因。这些基因的克隆有助于我们对欧李从亚显微结构进行研究与分析。目前已克隆基因为：

1)克隆叶绿体相关基因与欧李抗逆性的改良、糖原和支链淀粉的形成、光呼吸、氨基酸形成机制、生物多样性的分析和光保护机制等有关，如：1 928bp DNA 欧李 NADH脱氢酶亚基F(ndhF)基因，部分CD；728bp DNA 欧李克隆bop002867淀粉分支酶(SBEI)基因CDS部分；879bp DNA 欧李克隆bop002867假定RF1蛋白(YCF1)基因部分CDS；1015bp DNA 欧李克隆bop002867 RuBP羧化/加氧酶大亚基(rbcL)基因；1 234bp DNA 欧李克隆bop002867 tRNA的赖氨酸(trnK基因)基因部分序列；和成熟酶K(MATK)基因，部分CD；1 803bp mRNA 欧李叶绿体紫黄素脱环氧化酶(VDE)mRNA、完整的CDS。

2)克隆线粒体相关基因与欧李抵御低温胁迫的能力有关，如：1 559bp mRNA 欧李线粒体交替氧化酶(AOX)mRNA、完整CDS产品的核基因。

3)克隆水通道蛋白基因对于利用基因研究改良选育高质优产品种具有重要的意义，如：2 245 bp DNA欧李水通道蛋白PIP2(PIP2)基因，完整的CD。

4)克隆核糖核酸酶基因利于揭示欧李新的进化机制和功能分化，如：889 bp DNA 欧李S7核糖核酸酶基因CDS部分；309 bp DNA 欧李S3核糖核酸酶(S3)基因部分CDS；684 bp DNA欧李S4核糖核酸酶(S4)基因部分CDS；266 bp DNA 欧李自交S1核酸酶(S1)基因，s1-s基因CDS部分；806 bp DNA 欧李自交不亲和S6核糖核酸酶基因，部分CD； 441 bp DNA欧李自交不亲和S5核糖核酸酶基因，部分CD。

5)与抗逆性有关的克隆基因有1 872 bp mRNA欧李液泡H + - ATP酶催化亚基mRNA，完整的CD等等。

山西农业大学欧李种质创制与利用山西省重点实验室现已克隆出了欧李花色苷基因、油脂基因、有机酸相关基因、糖代谢基因及凝集素基因，这些基因的克隆有助更好的对欧李进行分子水平的研究，对开发其药食同源功能提供更好的基础。

1.3 蛋白水平方面

结合基因克隆研究者对基因进行了原核表达，诱导其表达出相应的蛋白质，如：NADH脱氢酶亚基F部分、水通道蛋白PIP2、 NAD依赖型苹果酸脱氢酶、液泡H + - ATP酶催化亚基、NAC转录因子、叶绿体紫黄素脱环氧化酶、线粒体交替氧化酶、淀粉分支酶，部分(叶绿体)、假定1蛋白部分(叶绿体)、isphosphate羧化酶/ xygenase大亚基，部分(叶绿体)、S7 RNase，部分、SRNase，部分、SRNase，部分、S4 RNase，部分、S3的RNase，部分、核糖核酸酶，部分、自交不亲和S1-RNase，部分、自交不亲和S2-RNase，部分、自交不亲和性S6 RNase，部分、自交不亲和性的S5 RNase，部分等，并对这些蛋白质的氨基酸序列和结构进行了分析，这有助于在蛋白水平上对欧李进行研究，更好的了解其功能。山西农业大学欧李种质创制与利用山西省重点实验室对其克隆的基因构建了相应的表达载体，下一步的研究中诱导其表达，进行免疫学研究和功能检测。同时可以多肽研究和开发功能蛋白，将其作为保健食品和功能食品，进一步开发药物或探针用于医学研究。

2 欧李果实食用与保健价值

欧李果实中有机酸含量1.0%～2.0%，是提取天然有机酸，也是改进高糖少酸饮料，制作健康饮料的首选原料。欧李有机酸的主要成分为苹果酸，果实酸度为苹果酸决定型，苹果酸含量高占到总酸含量的比率为69.78%～86.21%，是一种独特的保健水果[3]，L-苹果酸为天然果汁之重要成分，与柠檬酸相比具有酸度大，但味道柔和，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”。999bp mRNA欧李NAD依赖型苹果酸脱氢酶基因，完整的CD；1 779bp mRNA 欧李NADP-苹果酸酶mRNA的表达，完整的CD已被克隆，L-苹果酸在生物体代谢过程的作用和意义，显著的生理功能机制更好的被揭示。L-苹果酸中含有天然的润肤成分，能够很容易地溶解粘结在干燥鳞片状的死细胞之间的“胶粘物”，从而可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性；L-苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。欧李种质资源丰富，今后应开展多种种质材料中代谢酶与积累机制的研究。

欧李果实中酚类物质含量丰富，平均值为7.30～13.0 mg/L，果皮中含量最高，果肉次之，果汁中含量最低[4]，多酚是一类天然抗氧化剂和自由基清除剂，具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤、抗血脂等药理作用[5,6]。欧李仁多肽具有抗氧化作用，对DPPH·自由基的清除作用随浓度的增加几乎曾直线上升，IC50为2.69 mg/ml[7]。

目前从欧李花色苷中分离出6种花色苷类组分：矢车菊-3-葡萄糖苷、天竺葵-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-鼠李糖葡萄糖苷、天竺葵-3-鼠李糖葡萄糖苷、矢车菊-3-乙酰基葡萄糖苷、天竺葵-3-3乙酰基葡萄糖苷，矢车菊-3-葡萄糖苷占花色苷总量的62.6%[8]。花色苷属于黄酮类化合物，是一种分布广泛的天然色素，具有抑制血小板凝固，预防心脏病、血栓，抗癌[9]，抗氧化[10]，防止肝损伤等多种生理功能。欧李种仁平均含油率为41.5%，其中不饱和脂肪酸为96.29%，主要成分为油酸68.53%和亚油酸27.43%[11]，稳定好易被人体吸收，能阻止氧化自由基对血管的危害，并且能增进消化系统，促进骨骼和神经系统的发育。

3 欧李凝集素的研究

植物凝集素是指能可逆结合特异单糖或寡糖的蛋白或糖蛋白，而且具有广泛的细胞学和生理学功能。由于其特殊的糖蛋白结构特征，也可用于新陈代谢疾病方面的诊断。植物凝集素不仅存在于种子，根、茎、叶、皮、果实中也发现有凝集素。目前已经发现的植物凝集素1 000多种，存在于豆科、茄科、大戟科、本科、百合科和石蒜科等众多植物类群中，因此对新的凝集素的筛选也是一项重要的工作。现在对凝集素的研究更具体到了物种家族，双孢菇凝集素家族、蓝藻病毒蛋白家族、橡胶蛋白、榴莲凝集素、苦参凝集素家族，通过分离鉴定，对他们的性质、分子结构以及家族凝集素的不同功能，蛋白单体到寡聚体的组装过程作了大量的研究，许多工作已深入到基因水平。

欧李是一种备受关注且取得开发应用价值的优质野生果树资源，其营养价值丰富。课题组经过多年的研究已将其很好的应用与生产实践，在分子水平的研究方面已完成转录组的测定，亟待对其基因进行深层次的研究。山西农业大学欧李种质创制与利用山西省重点实验室对欧李凝集素CH-lectin基因进行克隆、氨基酸序列比对和蛋白结构、功能预测：欧李凝集素基因全长为2 404bp；用Blast对该基因序列搜索，得到目标序列与桃的相关基因序列高度同源，一致性达到96%；它编码一个全长800个氨基酸的蛋白质；其N端的19个氨基酸是信号肽，能够以亲水性分泌性蛋白形式表达，分子量为90.37kDa；蛋白二级结构主要为无规则卷曲；该蛋白亚细胞定位于叶绿体(类囊体膜)，含有一个甘露糖结合位点，二聚体结合位点，ATP结合位点，活性位点，多肽低物结合位点和活化环，预测其属于酪氨酸激酶，为甘露糖结合凝集素，而且与半刀豆凝集素有相似的结构域。甘露糖结合凝集素对肿瘤细胞有很好的诱导凋亡作用，半刀豆凝集素具有潜在的抗肝癌作用。欧李是蔷薇科野生果树，而且欧李是具有观赏价值的双子叶药食同源植物，目前对蔷薇科凝集素、双子叶植物凝集素的研究很少，这项研究恰好可以填补这一空白，开发出一种新型的凝集素基因家族，为医学事业的发展做出重要贡献。随着凝集素数据库的建立，糖键结构的分析，糖键合成的方法学，糖识别机制的阐明，欧李凝集素的结构将更加清晰，将有助于推动免疫学、病理学、分子生物学和细胞生物学等学科的发展，更有助于欧李药用价值的开发研究。

欧李作为药食同源植物之一，其栽培面积、产量、市场需求量不断扩大；新的品种不断培育(钙果系列、鲜食品种、加工品种、绿化品种)；加工产品种类不断增多(果啤、果酒、饮料、罐头等)；功能产品不断研发(食用油、茶叶、原浆酒等)；特别是从基因和蛋白角度对其的研究力度的加大(能量代谢、物质代谢、信息代谢)，更加有助于我们开发药用产品，治疗免疫疾病，神经疾病及肿瘤疾病等。因此进行“欧李、健康、生态”主题研究有利于以人为本，有利于可持续发展。