喷布外源褪黑素对缓解葡萄叶片晚霜冻害的作用

仝亚军，高玉录，刘孟龙，翟衡，孙庆华

(山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018)

褪黑素(melatonin，MT)是一种广泛存在于动植物体内的吲哚类小分子物质。研究证明褪黑素在提高植物抗氧化能力、增强抗逆性方面有重要作用，外源褪黑素能缓解盐胁迫对光合速率的抑制作用，抑制叶绿素的降解，在缓解高温、臭氧逆境胁迫方面也有明显效果[1-3]。外源褪黑素可减轻胡萝卜(Daucus carota)因低温诱导的细胞凋亡[4]；褪黑素预处理的黄瓜种子在低温条件下发芽率明显提高[5]；褪黑素能提高低温保存的红景天(Cryssulaceae Rhodiola crenulata)愈伤组织的存活率。褪黑素在植株叶片或根局部施用不仅在施用部位诱导对低温胁迫的耐受性，而且还可提高全株的耐寒性[6]。

中国北方属于大陆性季风气候，春季升温快，但气温变化波动大，发芽早的果树容易受到低温伤害。春季霜冻造成葡萄嫩梢、叶片、花器官发生冻害是是导致葡萄产量降低、品质下降甚至树体死亡的重要因素之一，所以研发葡萄防霜技术具有重要的生产实践意义。叶面喷施碧护、天达已被生产证实是预防和救护果树霜冻害的有效方法[7-9]，本研究以褪黑素、天达、碧护为处理，探讨外源褪黑素预防霜冻的作用。

1 材料与方法

1.1 试材

试验于2018年4月在山东农业大学园艺学院葡萄试验基地进行。以5年生篱架栽培的砧木SN15为试材。南北行向，株行距1.2m×2.5m，单干单臂垂直叶幕。

试剂：褪黑素购自Sigma公司；天达2116购自山东天达生物股份有限公司(净含量20mL)；碧护购自德国阿格福莱农林环境生物科技有限公司。

1.2 试验设置

设置4个处理，分别为①CK，自然霜冻条件下不作处理。②褪黑素100nmol/L。③碧护5000倍液。④天达600倍液。每个处理选长势一致的3株为1个重复，每处理重复3次，共9株。根据天气预报降温信息，各处理于4月5日即低温来临前1天喷施，于6日上午10时采样。统一选取新梢上部第1个叶片用液氮速冻后放-80℃冰箱保存。

1.3 测定指标与方法

电导率、丙二醛(MDA)含量的测定，电导率采用FE30型电导率仪测定[10]。硫代巴比妥酸法 (TBA) 进行MDA含量测定[11]。

脯氨酸含量测定，采用磺基水杨酸法。

抗氧化酶活性测定。酶液提取，称取0.5g植物材料放入研钵中，加5ml pH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，10000转/分钟冷冻离心20分钟，取上清液倒入试管中，置于0～4℃下保存待用(短期)。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定，采用氮蓝四唑光化还原法；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法。

2 结果与分析

2.1 霜冻来临前后温度变化

图1为4月2日中午12时至3日12时、5日中午12时至6日中午12时温度变化情况，4月2日中午温度最高达到30℃，并且白天温度维持在25℃以上，3日凌晨最低温16.6℃。5日17时至6日8时持续3小时低于0℃，最低温度达到-1℃。

图1 低温前后温度变化

2.2 不同处理的葡萄叶片受冻情况

低温发生时新梢长3～6cm，梢叶幼嫩，含水量较高，易受低温冻害。此次降温温度回升后观察发现，部分幼嫩叶片呈暗黑色，其中对照的梢尖叶片受害率达30.0%；喷施碧护的基本无外观症状，喷施褪黑素的叶片受害率5.0%左右，喷施天达的叶片受害率15.0%左右。

2.3 不同处理对葡萄叶片相对电导率和丙二醛MDA含量的影响

在温度逆境胁迫下活性物质会大量积累，细胞膜的结构遭到破坏导致叶片的相对电导率升高。如图2所示，对照叶片的相对电导率14.85%，喷碧护的比对照低26.0%，喷褪黑素的低20.9%，喷天达的低18.6%，均与对照差异显著，但三者之间没有显著差异。喷施3种化学制剂有利于减轻细胞膜结构的破坏程度。

图2 霜冻对葡萄叶片相对电导率的影响

MDA是膜脂过氧化的最终产物之一，其含量的多少可以反映细胞膜脂过氧化程度的高低。葡萄遭受低温后MDA含量升高(图3)，以对照叶片中的MDA含量最高，达到0.023μmol/g FW，喷碧护和天达的分别比其低84.4%、45.7%，喷褪黑素MT的低20.9%。

图3霜冻对葡萄叶片丙二醛(MDA)含量的影响

2.4 不同处理对葡萄叶片脯氨酸含量的影响

葡萄植株遭受低温胁迫后叶片的脯氨酸含量升高，如图4所示，对照脯氨酸含量最高，为2.41μg/g FW；喷施天达的与对照无显著性差异，喷褪黑素的为对照的92.5%，喷碧护的为对照的91.0%，且与其他两个处理差异显著，说明轻微霜冻条件下喷碧护对叶片的脯氨酸含量有明显稳定作用。

图4 低温对葡萄叶片脯氨酸含量的影响

2.5 不同处理对葡萄叶片SOD、POD活性的影响

植物体内有完善的清除活性氧的防卫体系，能保证体内活性氧处于动态平衡的状态。植株遭受逆境胁迫时体内活性氧会积累。POD和SOD是植物抗氧化酶体系中重要的防御酶，可以有效清除积累的活性氧，减轻细胞遭受的损伤。如图5，图6可见，对照的SOD、POD活性分别为199.93U/min·g FW、3.17U/min·g FW，3个处理叶片的SOD、POD活性上升幅度均小于对照，其中SOD活性喷碧护为对照的65.8%，喷褪黑素为对照的69.3%，喷天达为对照的76.8%。3个处理对POD活性的影响有明显差异，其中喷天达的是对照的81.2%，喷碧护的是对照的54.6%，而喷褪黑素的POD活性增加幅度最小，仅为对照的41.9%。说明POD活性对褪黑素更加敏感。

图5 葡萄遭受霜冻过后叶片SOD含量的变化

图6 葡萄遭受霜冻过后叶片POD含量的变化

3 讨论与结论

逆境温度会使细胞内活性氧积累，从而导致细胞膜脂过氧化，最终对植物造成伤害甚至死亡[12-16]。本试验结果表明，在轻度低温胁迫后葡萄幼叶的MDA含量明显上升，相对电导率升高，喷布褪黑素、碧护、天达处理的MDA含量和相对电导率均显著低于对照，说明经处理过后，减轻了葡萄叶片细胞膜脂质过氧化，保护了膜的完整性，减小电解质的外渗，以碧护处理效果最明显。

SOD是清除活性氧的主要酶类[17,18]，也是植物细胞防御系统中一个极为重要的保护酶类。POD可以使组织中所含有某种碳水化合物转化成木质素，增加抵抗寒冷的能力[19]。受到低温伤害后未进行任何处理的葡萄幼叶SOD和POD活性显著高于3个处理，3种防霜物质都明显抑制这些指标的上升。

有研究发现植物遭受逆境胁迫时其体内的脯氨酸含量增加，有助于细胞或者组织保持一定的水分，从而使植物细胞的渗透势下降，以提高抗低温胁迫的能力[20]。发生低温胁迫后对照的脯氨酸增加幅度明显高于3个处理，褪黑素与碧护的反应水平类似。

综上所述，在-1℃低温胁迫造成了葡萄幼叶的表观伤害和膜脂过氧化，也调动了各种抗氧化抗寒物质的响应[21]，导致脯氨酸含量、SOD、POD活性上升，而3种防霜物质都明显抑制了这些指标的上升，说明在轻度低温胁迫下喷布这3种物质使葡萄叶片受冻程度减轻，喷布外源褪黑素与生产上推荐使用的天达及碧护有类似效果，因此褪黑素作为一种强抗氧化剂对生态逆境的缓解作用值得进一步研究探索。