细胞铁死亡在心脏手术后急性肾损伤中的研究进展

郎正鹏 向道康，△ 胡馗 向龙 曲昊楠 高鲁方

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.贵州省人民医院心外科，贵州 贵阳 550002)

CSA-AKI是一种心脏手术术后并发症，导致心脏手术后的病死率增高。CSA-AKI是ICU中AKI的第二大常见原因，并且与发病率和死亡率增加独立相关[2]。根据不同的研究人群及诊断标准不同，CSA-AKI发生率在3%～42%[1-2]，严重的CSA-AKI导致围手术期死亡率增加3～8倍，与ICU和病房住院时间延长，以及护理成本增加独立相关[3]。无论其他风险因素如何，心脏手术后10年内AKI相关死亡风险仍然很高，即使对于完全肾功能恢复的患者也是如此。正如识别和纠正术前危险因素一样，明确CSA-AKI的发病机制，从而在手术期间和手术后使用预防措施来改善肾功能对于提高这些患者的术后发病率和死亡率至关重要。最近的大量研究表明，细胞铁死亡这种特殊的肾小管细胞坏死形式是CSA-AKI可能的机制。

1 CSA-AKI的研究现状

体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)的复杂影响通常会诱发一定程度的AKI。包括来自非搏动性低血流，低压导致灌注不足，血液稀释，快速的升降温度，炎症反应，细胞破坏，过氧化状态持续存在以及氧化应激等都可能是术中导致CSA-AKI的病因。在术后早期期间，低心输出量的状态，缺血缺氧后再灌注损伤也可能是CSA-AKI的病因。心脏手术后AKI的发病机制尚不完全清楚。单个病因因素不太可能导致CSA-AKI。这是术前，术中和术后通路的多重互动的结果。目前国内外没有针对CSA-AKI专门制定的诊断标准，多是采用RIFLE，AKIN，KDIGO诊断标准等作为参考，三种诊断标准均采用SCr及尿量作为诊断指标，然而，SCr受种族、性别、年龄、饮食、肌肉质量、血管内容量负荷和药物的影响，与肾功能本身并无关，即使肾功能降低50%，SCr浓度变化也可能不会超过正常值范围[4]。在预测AKI方面，尿量作为诊断标准中不可或缺的参考标准之一，其并没有办法把肾前性、肾性少尿或缺血性、肾毒性肾损伤区分开来[5]。TRIBE-AKI研究表明，除临床危险因素外，使用生物标志物人类嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)时，CSA-AKI风险预测值提高了18%[6]。基于RIFLE，AKIN和KDIGO标准而制定的干预CSA-AKI措施不能实现早期干预AKI，不断研究CSA-AKI的发病机制对于改善监测，早期制定治疗措施从而改善患者术后的愈后情况[7]。大量的研究表明NGAL、铁调素、α-1微球蛋白、血幼素、脂肪酸结合蛋白等CSA-AKI早期生物学标志物均涉及同一个关键的机制，即心脏术后肾脏由于铁稳态失衡及脂质过氧化所致的细胞铁死亡机制。有学者[8]研究表明铁稳态的破坏是导致CSA-AKI的一个关键机制，并且监测游离铁及铁稳态相关的调节指标可以在早期直观的反应的损伤情况，从而为早期干预提供相应的数据支持。

2 细胞铁死亡的机制

铁是人体最丰富的必需微量元素之一，它广泛参与氧运输、电子转运、DNA 合成，细胞增殖、分化，基因表达调控等生命过程，铁过载会因铁沉积在重要脏器而对生存产生显著影响。身体存在严格的铁代谢调节机制，以确保体内铁处于铁稳态[9]。随着对铁代谢研究的深入，研究者发现大部分铁过载都会对机体造成严重损害。 在铁过载状态下，过量的游离铁在细胞内可催化具有高反应破坏性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，激活氧化应激反应，损伤细胞膜结构、蛋白质及DNA，进而导致细胞凋亡、组织损伤[10]，最终引起肾脏疾病、肝脏疾病、心血管疾病、阿尔茨海默症、帕金森病、2 型糖尿病等多种疾病的发生[11]。Ferroptosis在2012年由Dixon首次提出，其中铁的参与是这种特殊的细胞死亡形式的一个显着特征，随着铁和ROS的获得，它被定性为非凋亡性过氧化诱导的细胞死亡[12]。铁死亡不能被细胞凋亡、细胞焦亡、细胞自噬的抑制剂所抑制，却可以被铁螯合剂、抗氧化剂等所抑制，因此铁死亡是铁依赖性的、以脂质活性氧增多为特点的特殊细胞死亡形式[13]。Ferroptosis总结起来是一个中心，两种细胞事件，四个方面而发生的：一个中心即是细胞脂质得过氧化物累积；两个细胞事件即细胞抗氧化库的破坏和细胞内铁的增加，导致有毒的脂质过氧化物的累积；四个方面分别包括铁的依赖性、活性氧物质的产生、细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)的消耗、脂质过氧化物的积累。在形态学方面，Ferroptosis不具有细胞凋亡的形态学特征，没有传统细胞凋亡时出现的现象如细胞皱缩、染色质凝集、凋亡小体的形成、细胞骨架的解体等现象的发生，通过电子显微镜可以观察到线粒体明显皱缩伴膜密度增加，这是细胞凋亡所没有的[14]。在生化方面，目前的研究认为铁死亡主要依赖于铁过载和GPx4的大量消耗，从而产生细胞质和脂质的ROS聚积。肾小管上皮细胞富含线粒体及细胞内铁，是活性氧和铁离子功能极其活跃的部位[15]，对缺血氧极其敏感，故在CPB之后，肾小管上皮细胞极有可能以铁死亡方式参与肾损伤。但是也有人提出，Ferroptosis主要发生在缺血再灌注的哪个阶段目前不能完全精确定位下来，其研究的心肌缺血缺氧再灌注中发现不同阶段发生的Ferroptosis发生率有很大差别，进一步的精确定位对于精准定位至关重要[16]。R.Skouta等[17]研究表明，Ferrostatins(一种Ferroptosis抑制剂)在急性肾损伤模型新鲜孤立肾小管中起到保护作用，阻止发生致命性损害，表明在急性肾衰竭中可能存在铁死亡介导的细胞死亡。有学者[18]在研究中指出：利用第3代ferrostatins抑制铁死亡能削弱缺血再灌注损伤引起的急性肾衰。

3 铁死亡与CSA-AKI

CSA-AKI的发病机制复杂且多因素，包括几种损伤途径：缺血和再灌注、外源性和内源性毒素释放、炎症、氧化应激和血液动力学因素。这些损伤机制可能在不同时间以不同的强度发挥作用，并可能协同作用，其中涉及到一个关键的节点即是游离铁的释放[19]。与非CPB操作相比，CPB期间的缺血再灌注损伤可能在的游离铁的催化下进一步加剧氧化炎症应激。游离不稳定铁能够诱导肾小管上皮功能的多种变化，如诱导自由基损伤、脂质过氧化、蛋白质氧化以及DNA变化等。游离铁离子催化羟自由基及过氧化物的产生，并且在酸性pH下更具活性。

3.1铁稳态失衡在CSA-AKI中的作用 非搏动性血流、微栓塞的血流动力学状态、血液稀释及CPB相关的快速温度变化，在从完全的CPB血流动力学支持到患者自身心血管系统的完全循环过渡期间，可能发生血流动力学不稳定，而这种低心输出量状态将导致全身低灌注及肾缺血[20]。在缺血期间，pH降低或超氧化物诱导的Fe3 +还原导致蛋白质结合的细胞内铁的解离，从而增加游离铁的水平。游离铁的增加可能导致氧化应激和细胞损伤，导致肾小管坏死。CPB期间的再灌注损伤可能会给肾脏带来额外的铁，并携带上游坏死肾细胞释放的铁进一步下降至下一个肾单位，进一步加剧氧化应激从而导致组织损伤[21]。 CPB将血细胞暴露于机械性的CPB管道系统，外科手术中吸引装置，置换的瓣膜假体等非生理表面和剪切力，导致机械破坏红细胞，释放游离血红蛋白进入循环[22]。在CPB使用期间观察到游离血红蛋白水平增加超过上生理范围几倍，直至手术后数小时[23]。已知的色素性肾病是由血红蛋白尿和肌红蛋白尿导致，在CPB期间血红蛋白增加与早期术后肾小管损伤相关，并且是之后肾功能丧失的发展显著独立危险因素[24]。CPB的持续时间越长发生的溶血越多，从而产生更多的游离血红蛋白。游离血红蛋白与触珠蛋白结合形成一种复合物，最终经过肾脏代谢而被排出。血红蛋白由4个蛋白质链和4个血红素基团组成，血红素结构的中心有氧化还原活性铁，能够参与有机和无机氧自由基反应，如刺激脂质过氧化和催化形成破坏性羟自由基，随后导致组织损伤。在存在氧化剂如过氧化氢和超氧化物的情况下，游离铁从血红素分子释放到循环中。游离铁具有催化Haber-Weiss和Fenton反应的作用，从而催化超氧自由基和过氧化氢产生羟自由基。肾小管尿液的典型酸性环境增强了反应性羟基自由基的形成，因为Haber-Weiss反应是pH依赖性的，当pH降低时右移。在动物研究中，游离血红蛋白的输注及其向高铁血红蛋白的转化过程中诱导肾脏发生急性损伤，并且酸性条件将加重这一反应[25-26]。碱性条件下输注血红蛋白几乎不会导致肾损伤，尿碱化可减轻动物模型中的肾功能衰竭。生理上，转铁蛋白是游离铁再循环和吸收入血的主要蛋白，转铁蛋白结合游离铁并最大限度地减少其潜在的毒性。然而在CPB过后，游离铁的释放可能超过转铁蛋白的铁结合能力。较低水平的术中铁结合蛋白可能反映了CPB期间释放的催化铁的能力受损，从而导致肾损伤。研究数据显示铁稳态在人类缺血再灌注损伤中非常重要，并表明它是心脏手术期间潜在可改变的风险。此外，游离血红蛋白能够清除内皮衍生的一氧化氮，导致血管收缩、肾血流量减少、血小板活化、内皮素-1表达增加从而加重AKI。一些游离血红蛋白也会通过肾小球，并出现在尿液中释放游离铁(参与活性氧的产生)，并可能导致肾小管阻塞、血红蛋白铸型和肾小管细胞坏死。肾小管的阻塞将导致更长时间的内吞摄取游离血红蛋白进入近端肾小管细胞，这与近端肾小管细胞坏死有关[25]。此时，所有铁结合抗氧化能力都丧失，游离铁显示出更强的促氧化特征[28]。还有证据表明，活性氧物质的产生可能有助于急性肾小管坏死的发生和持续损伤状态[29]。游离铁导致的氧化应激在AKI的发展中起关键作用，被认为是肾小管损伤的重要原因，游离铁可能来自CPB中的溶血或从上游肾小管中受损的线粒体释放[30]。

3.2针对铁毒性的肾脏保护方法 在急性肾衰竭的大鼠模型中，通过使用碳酸氢钠输注实现碱化尿液，从而在肾小管中维持较高pH是具有非常大的保护性意义的。来自双盲随机对照试验的证据表明，用碳酸氢钠碱化尿可以减轻CSA-AKI，可能直接影响与铁相关的毒性[31]。在中性或碱性pH下，游离的铁离子以不溶的氢氧化铁形式沉淀，其作为尿液中的惰性复合物排出。碱性尿液可减少有害羟基自由基的产生和脂质过氧化，碳酸氢盐直接清除氢氧根离子，并且与氯化物相比作为不易吸附的阴离子，以更快的速度排出，从而减少有害自由基和肾小管之间的接触时间。在庆大霉素诱导的AKI大鼠模型中，铁螯合剂去铁胺(DFO)可以减轻自由基损伤[32]。DFO是一种铁离子螯合剂，其防御机制[33]：(1)去除游离铁、降低组织中铁离子浓度，使正常氧下低氧诱导因子-1的降解受到阻碍，并且转录增加，最终DFO可以通过增加组织细胞内低氧诱导因子-1的含量来发挥对缺血再灌组织的保护作用。DFO与铁结合形成铁胺(DFO与铁的复合物)，其非常稳定且分布在细胞外空间，不能进入细胞内，去铁胺的这种作用是减少肾脏缺血再灌注损伤最重要的原因之一。(2)清除自由基或抑制其形成。DFO自身也是一种自由基清除剂。能与OH·和O2-直接反应，它在H2O2存在下被过氧化物酶氧化形成氮氧化合物，清除过氧化阴离子。(3)上调内源性抗氧化的保护作用：DFO可降低肾脏继发性损伤后局部组织丙二醛的含量，表明DFO具有较强的抗脂质过氧化能力，上调内源性抗氧化防线。

4 总 结

综上所述，心脏手术过程中使用到的CPB技术，本身导致了氧化应激的增强，使机体处于一个过氧化状态，大量的消耗了抗氧化系统物质。而其本身的非生理性管道及非博动性血流等将导致红细胞的破裂释放出的大量的血红蛋白及自由铁，并使机体出现缺血再灌注的发生从而加重氧化应激反应。机体出现缺血缺氧损害后，机体长期处于一个酸性的微环境中，有利于羟自由基的大量生成，并且再次灌注还将带来大量的游离铁，而此时的铁稳态系统进一步失衡导致了大量的脂质过氧化发生，从而导致了肾小管细胞特殊铁依赖性死亡。在缺血缺氧诱导肾小管上皮细胞损伤过程中，铁死亡可能是肾小管上皮细胞较早出现的损伤方式，抑制细胞铁死亡的发生可以减轻缺氧对肾小管上皮细胞的损害[34]。因此，铁死亡可能是CSA-AKI的一种机制。