角膜新生血管的显影方法

许 多，何宇茜，王瑞卿，李富强，姚博远，张 妍

0引言

生理条件下，角膜是不含血管和淋巴的透明介质，因此被免疫系统忽略而处于“免疫赦免”的状态。但在病理条件下，角膜缘的血管向角膜内延伸，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)因此形成。目前常见的方法，如激素治疗[1]、细针透热[2]、光动力疗法[3]等，只能在一定程度上抑制CNV的生长，作用时间短，并伴有副作用，因此对CNV特异性抑制的治疗方法还在不断探索。CNV会引起视力下降、视物模糊，甚至失明[4]，在探索药物疗效的研究中，CNV的面积是衡量药物或者治疗方案效果好坏的重要参考，CNV高效清晰的显影对研究也有重大价值。目前针对CNV的显影方法有显影剂造影、免疫组织化学法、光学相干断层成像技术(optical coherence tomography，OCT)等。本文就CNV的显影方法进行综述，分析每一种显影方法的优缺点，希望能对后续的研究起到一定的参考作用。

1显影剂造影

用显影剂对CNV造影可以实时快速地成像，具有操作简单、易于观察等优点。造影后的图像使用荧光显微镜技术进行观察，但是荧光显微镜得到的图像质量不高，分辨率较低。随着技术的发展，激光共聚焦技术[5]显著地提高了分辨率，并且能对切片进行三维成像。

1.1荧光素钠荧光素钠(fluorescein sodium)分子式为C20H12O5，分子量为332D。利用荧光素钠对CNV造影是经典方法之一[6]，将荧光素钠注入静脉，或者从左心室灌注，荧光素钠随着血液流入血管，使CNV清晰可见[7]。荧光素钠被蓝光激发时显示出黄绿色光。由于它不参与机体代谢，因此该方法具有毒性低、不良反应少等优点，现在也用于检查角膜是否破损。传统观点认为，角膜完好的地方不着色而仅在损伤处染色，但有趣的是，在Bandamwar等[8]研究中发现，健康内皮细胞也可以被着色，不过破损或者衰老的细胞显示出更强烈的荧光[9]，即“中等强度背景下的超荧光”(hyper-fluorescence)。

1.2吲哚菁绿吲哚菁绿(indocyanine green)的化学式为C43H47N2NaO6S2，分子量为775D。同样，吲哚菁绿也能与血浆白蛋白、球蛋白等物质结合，但对血管的显示更加精细，具有轮廓清晰、定位精确等优点，目前已应用于临床，因为它可以增强眼内结构层次的对比度，从而使手术更加方便。在实际操作的时候，可以将吲哚菁绿和荧光素钠混合进行染色[2,10]。不过以上两种染色方式均为侵入性检查，需要在静脉中注射造影剂才能显影，也会在一定程度上损伤眼组织。有文献报道，吲哚菁绿对视网膜有潜在的毒性，并且渗漏的造影剂也会降低显影效果，影响最终结果的评估。

1.3伊文氏蓝伊文氏蓝(Evans blue)是一种偶氮染料[11]，分子量为960.8D，化学分子式为C34H24N6Na4O14S4，能不可逆地结合血浆白蛋白，形成复合物。而血管内皮细胞膜上有血浆白蛋白受体，其与血浆白蛋白亲和力较强，因此可以通过灌注方法显示血管形态。复合物在白光下呈蓝色，在荧光显微镜绿光下呈鲜红色，灵敏度很高，不易淬灭，易于长期保存，但该方法不能复染[12]。

2光学相干断层成像技术

裂隙灯观察CNV是一种常见的、十分简便的方法，能够对活体CNV的生长状况进行初步观察和粗略判断，在实验动物建模期间可以经常使用这种方法以观察角膜的各个部位。但涉及精细观察和准确判断时，不得不提到OCT[13]。角膜是无色透明介质，利用相干光进行检测，光线容易进入角膜。在眼科应用该技术，可为我们提供有价值的信息。其最大的优点在于能够快速、非侵入式[14]地评估CNV，还可以获得血流量、血管面积等重要数据。相比荧光素染色，这种无需使用造影剂的方法简单快捷、分辨率高、诊断精确，还能无创伤地追踪观察。OTC技术于1991年被提出[15]，对眼科诊断有着革命性的促进作用，在未来有很大发展空间。

3墨汁灌注

大鼠在深麻醉状况下，向左心室或主动脉注入生理盐水使得CNV褪色[16]，再注入明胶-印度墨汁-生理盐水混合成的色胶灌注新生血管[17-18]，并用液氮迅速冷却眼球或放入冰箱冷冻，分离角膜后在其周围做切口使角膜变平，此方法能非常直观地显示出血管轮廓，可用图像分析软件对血管的面积进行测量，从而获得精确的数据。从最开始易于褪色的单纯墨汁染色到现在加入明胶固定，该方法经过多年改进日趋完善，有价格低廉、操作简便、重复性高等优点。但是其显影效果受到灌注方法、温度、压强等因素影响，并且一些细小的血管可能没有灌注完全，适用于批量处理死亡的实验动物。

4免疫组织化学染色

虽然HE染色方法在过去几十年里得到了广泛的应用，能在一定程度上对CNV进行基础的观察，但是难以满足对研究的精细测量需求。而免疫组织化学染色具有高灵敏度、强特异性和准确定位的优势，能对CNV情况进行定性定量的观察。目前，显示血管内皮细胞的抗体种类繁多[19]，较为常用的主要抗体有CD31、CD34、Ⅷ因子等，然而它们并未完全显示所有微血管，并且在不同文献中报道的标记范围和标记效应存在差异[20-22]。

4.1血管内皮生长因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)能够刺激血管的增生，促进血管内皮细胞生成，并在CNV内皮细胞中强烈表达。已经有研究表明[23-25]，VEGF在CNV中可以被免疫组织化学染色法检查出来，可见血管的管腔样结构，阳性组织中可见棕黄色颗粒，但部分炎性细胞也呈阳性。

4.2 CD31微血管的标记和血管密度的测量也可利用CD31进行显影[26]。CD31是血小板内皮细胞黏附分子，它可以在新生成的以及正常组织的血管内皮细胞中表达，是常见的标记物。血管内皮出现棕色颗粒作为阳性染色标准。与Ⅷ因子比较，其能更清楚地显示微小的新生血管[27-28]。但是CD31特异性并不是很高，也会对组织中的基质细胞等染色，影响实验结果。

4.3 CD34CD34是由糖蛋白组成的抗原，在多种细胞表面均可表达，包括基质细胞、上皮细胞、造血细胞和内皮细胞。它不仅在微血管内皮细胞中表达，而且在正常血管甚至大血管中表达。因此抗CD34染色能较为理想地显示微小的、新生的、不成熟的血管和原先存在的大血管[29]。CD34是内皮细胞分化的高度敏感性标志物，抗CD34对新生内皮染色较正常内皮细胞更深。CD34具有背景染色清晰、轮廓明显、对比度高等优点，其被认为是重复性最理想的内皮标记物[30]。

4.4 CD105CD105相比于CD34和CD31，其更为稳定，也有更高的特异性，但CD34和CD31对正常微血管系统染色效果较好[31]。CD105对成熟血管具有弱亲和力，通常低表达或无表达，但在增殖的内皮细胞中高度表达。因此，它被认为是血管生成的可靠标志物[32]。研究表明，CD105是染色新生血管的理想选择，但不适用于正常的微血管反应[33]。

4.5 Ⅷ因子Ⅷ因子是一种正常组织血管内皮细胞中非常重要的凝血蛋白，参与体内血液凝固，常用来标记新生的血管内皮[34-35]。Jason等研究中发现，CNV内皮细胞能产生Ⅷ因子，并且染色效果良好[36-37]。

4.6 Weibel-Palade小体Weibel-Palade小体(Weibel-Palade body，WPB)是内皮细胞的细胞器，对正常止血和炎症反应至关重要。它的主要成分蛋白是血管性血友病因子[38](Von Willebrand，vWF)，vWF是一种多聚体蛋白，能参与凝血，在内皮细胞、血小板和巨核细胞中表达。

4.7 JG-12染色JG-12仅由血管内皮细胞合成，是一种小鼠抗大鼠氨肽酶P的单克隆抗体，能高效地检测和定位血管内皮[39-41]，从而特异性标记CNV，毛细血管内皮胞浆内可见棕黄色颗粒。

4.8 Ki67Ki67是一种核内蛋白质，与细胞有丝分裂关系密切，在除G0期外的细胞周期所有阶段均有表达，现在已经成为一种被广泛使用的增殖标记，因此可以使用Ki67免疫组织化学来检测CNV内皮细胞增殖情况[42-43]，在阳性细胞的细胞核中可见棕黄色颗粒。

4.9巢蛋白巢蛋白(nestin)定位于细胞质，是一种中间丝蛋白，参与细胞骨架重构[44-45]。组织成熟时，巢蛋白的表达被终止。因此巢蛋白能表达于新生的以及不成熟的小血管。对于CNV的显影，因为抗巢蛋白的抗体能特异性识别，所以使用巢蛋白抗体标记也是不错的选择。

5展望

CNV显影的方法很多，其精细程度也不同。粗略观察可以使用裂隙灯、HE染色等方法，而精细观察可以选择免疫荧光染色或者光学相干断层扫描血管造影。相信随着科技的发展，显影方法也会不断进步，敏感性更好、特异性更高的标志物也会不断被发现，OCT的分辨率和穿透力也会得到进一步的提升。目前还没有能全面显示所有CNV的特异性标志物，本文所列举的方法大多也同样适用于其它新生血管。是否存在能够特异性识别CNV的内皮细胞的标志物，各种染色方法联合应用效果如何，怎样才能让CNV尽可能多地显影，这些问题值得进一步的研究。