miR-132在糖尿病视网膜病变患者血浆中的表达及其临床意义

刘 茹，陆晓和

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最严重和最为常见的微血管并发症之一。世界卫生组织公布，DR是全世界导致视力缺损和失明的第二大原因，已成为眼底病基础和临床研究领域的难点和热点，探究DR的发病机制及预防策略具有重要的临床意义。

miRNAs可参与肿瘤形成、炎症反应、细胞增殖和凋亡、糖尿病和心血管疾病等多种病理生理过程。miRNAs也存在于人的循环血液系统中，能够从外周血检测，而且稳定性与重复性相对较好[1]。与mRNA不同的是，miRNAs在体液中相对稳定，甚至能抵御RNA酶的消化作用[2-3]。这一特性使外周血miRNAs检测有望成为恶性肿瘤及其它疾病新的非创伤性的标记物[4-5]。在对DR的研究中，视网膜组织标本很难获得，为病理检查和病理分析带来很大困难，因此如果外周血miRNAs检测能够作为标记物应用于临床，这对于DR患者将具有更为显著的临床意义[6-7]。临床上，miRNAs在玻璃体液和房水中也可以检测到特异性的表达[8-9]，Hirota等[8]研究表明，与新生血管化和纤维化有关的几种miRNAs在DR患者玻璃体液中的表达明显高于黄斑裂孔患者。这就使得miRNAs在玻璃体和房水中的表达差异可以提示某种疾病，为临床提供一种诊断和预后的分子生物学标志。Wu等[10]在链霉素注射10wk后成功建立糖尿病大鼠模型，并在糖尿病大鼠模型的视网膜内发现有11中microRNAs明显升高，包括miR-182、miR-96、miR-183、miR-211、miR-204、miR-124、miR-135b、miR-592、 miR-190b、miR-363、miR-29c-5p，并且有6种MicroRNAs显著降低，包括miR-10b、miR-10a、 miR-219-2-3p、miR-144、miR-338、miR-199a-3p。同时惊喜地发现，部分microRNAs在视网膜内表达量的变化与DR的发展一致，这就表明microRNAs调节与DR之间有某种联系。

microRNA-132(miR-132)是马克斯普朗克学会Lagos-Quintana等[11]2002年在小鼠神经组织中首次发现的，有研究表明[12]，miR-132与胃癌的预后密切相关。最近Marler等[13]通过体外和体内实验发现经由miR-132与p250GAP途径，脑源性神经营养因子促进小鼠胚胎视网膜神经节细胞的生长。临床上，我们发现处于同一阶段的糖尿病视网膜视神经病变，预后可能截然不同，提示我们可能视网膜神经节细胞损伤程度不同，这就迫切需要一种分子生物学标志能够提示这种凋亡。已有研究表明[14]，miR-132在DR大鼠血管内皮细胞中表达水平升高，那么在DR患者循环体液中miR-132的表达情况，目前尚不清楚。本研究通过探讨miR-132在不同分期DR患者血浆中的表达变化，有助于揭示miRNA-132与DR发展的关系，以期为DR寻求新的生物标志物。

1对象和方法

1.1对象选取2015-07/10于我院内分泌科确诊的55例糖尿病患者，并由眼科医师专人行眼底散瞳检查和荧光素血管造影(fluorescein angiography，FFA)检查，所有患者抽血前均未接受过眼部治疗。糖尿病诊断标准[15]：空腹血糖>7.0mmol/L或者OGTT 2h血糖>11.1mmol/L和糖化血红蛋白>6.5%。按DR国际临床分期标准将患者分为5组：背景期：无明显视网膜病变组13例(A组)；非增殖期(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)33例，包括轻度NPDR组10例(B组)，中度NPDR组11例(C组)，重度NPDR组12例(D组)；增殖期(proliferative diabetic retinopathy，PDR)9例(E组)。另选取我院体检健康者12例作为阴性对照组(F组)。排除标准：眼部手术史，伴有严重高血压病、严重高血脂症、恶性肿瘤、肺部疾病及自身免疫性疾病患者，合并其他影响糖代谢的疾病(如甲状腺功能亢进等)，急性代谢紊乱综合征，严重心脑血管疾病及外伤等。所有研究对象的年龄及是否规范控制血糖差异无统计学意义(P>0.05)。本次研究经郴州市第一人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均为自愿参加本次试验，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1资料收集由专人收集研究对象的一般资料，包括：性别、年龄、既往史、个人史、糖尿病持续时间、血糖、糖尿病并发症、用药史。

1.2.2试验方法抽取所有研究对象肘静脉空腹全血5mL，按照Tiangen miRNA提取试剂盒进行操作提取RNA，并检测RNA纯度，miRNA-132逆转录应用加尾方法，U6应用普通逆转录方法逆转录通用引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG( T )24N( A，G，C)-3’。PCR下游引物：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；miRNA-132上游引物：5’-TAACAGTCTACAGCCATGGTCG-3’。U6上游引物： 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用SYBR Green I染料法进行荧光定量PCR (qRT-PCR)检测，PCR反应条件为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火20s，60℃延伸20s，共40个循环，测量miR-132和U6的相对表达量。

2结果

2.1基本资料DR各组与健康对照组在男女构成比例方面，差异有统计学意义(P=0.049)；各组在年龄、是否规范治疗方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各组间糖尿病病程比较，差异有统计学意义(P=0.010)，糖尿病病程越长，DR越重(表1)。

2.2 PCR产物熔解曲线熔解曲线分析结果显示熔解曲线形成单一峰，表明无非特异性产物和引物二聚体形成，引物的特异性良好(图1)。

2.3 miR-132在各组患者血浆中的表达及与临床资料的关系与健康对照组相比，除无明显视网膜病变组外，其余各组DR患者血浆miR-132的表达水平均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；非增殖期各组间、非增殖期与增殖期组间比较，miR-132表达量差异均无统计学意义(P>0.05，图2)。本试验收集患者年龄、性别、糖尿病病程、是否规范治疗作为影响患者血浆miR-132表达的因素。对以上因素与血浆中miR-132含量的关系进行分析，结果发现以上因素均与血浆miR-132表达无相关性(P>0.05)。

3讨论

目前，miRNAs表达量的检测方法主要有4种：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、miRNA芯片微阵列、分子探针技术、直接测序技术。其中qRT-PCR较其他方法特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确，更适合分析体液中得到的miRNAs。本研究中我们采用qRT-PCR方法检测糖尿病患者血浆中miR-132的相对表达水平，且PCR熔解曲线为单一波峰，说明miR-132引物的设计和反应条件的优化均较好，另外我们在试验中有效地避免了RNA酶的污染，同时采用U6作为内参，提示本试验的数据具有较高的可信度。

表1 糖尿病视网膜病变患者和健康对照组的临床特征

分期例数性别(例,%)男女年龄(x±s,岁)病程(x±s,a)是否规范治疗(例,%)是否背景期组135(39)8(61)55.2±3.123.9±2.74(31)9(69)轻度NPDR组104(40)6(60)56.1±5.85.8±3.77(70)3(30)中度NPDR组113(27)8(73)59.3±8.98.9±4.86(55)5(45)重度NPDR组124(33)8(67)63.1±11.812.6±5.54(33)8(67)PDR组92(22)7(78)63±16.116.2±4.63(33)6(67)健康对照组126(50)6(50)57.4±4.70-- P0.0490.3270.0100.526

图1miR-132与U6熔解曲线A：miR-132；B：U6。

图2miR-132在各组患者血浆中的表达A：miR-132在各组患者血浆中的表达；B：miR-132在NPDR与PDR两组的表达。aP<0.05vs健康对照组；cP<0.05vs背景期DR。

miRNAs的自身结构比较特殊，目前应用较多的有两种检测方法：茎环法和加尾法，在原理上存在差异。两种方法的反转录引物设计原则不同，而PCR 扩增引物的设计原则是相同的，也遵守常规PCR的引物设计原则。这两种方法的思路不同，导致引物设计和试验方法上的差异。二者各有优缺点，茎环法引物设计较困难，大量检测成本高，但其特异性、灵敏度高于加尾法；而加尾法引物设计相对简单，操作容易。本试验中，最初设计用茎环法，但是在预试验中发现，茎环法PCR结果中，水的PCR产物中出现目的条带，提示我们存在污染可能性，后改为加尾法进行miRNAs的qRT-PCR试验。

miRNAs一般在细胞间隙内发挥生物学作用，但在人类生物体液，如血清、血浆、尿液、唾液、泪液、房水和玻璃体中也能检测到稳定的miRNAs[16]，体液中的miRNAs不仅是在标准状态下稳定，而且在经受冷冻、pH剧烈变化、长时间放置室温下都不会发生改变[3]，因此人们设想把它作为人类疾病病理学的分子标记来进行研究，并且在很多疾病中已经报道了循环中的miRNAs表达谱，包括糖尿病疾病[17-19]。miR-132在糖尿病大鼠的视网膜血管内皮细胞中表达上调[14]，而在DR患者外周血循环中miR-132的表达情况，尚未见相关文献报道。

本研究发现miR-132在健康人和无明显DR患者血浆内表达量相对较高，在非增殖期和增殖期DR患者体内miR-132表达量降低，这提示在DR发展过程中，miR-132有可能也起了保护视网膜神经节细胞作用，从而阻止DR的发展，当miR-132下降时，可能提示病变进展，但随着DR程度加重，miR-132表达量差异无统计学意义。而Kovacs等[14]研究表明，miR-132在DR大鼠血管内皮细胞中表达水平升高，与我们的试验结果不一致，分析原因本次试验检测的是视网膜神经节细胞，而Kovacs等检测的是miR-132在DR大鼠视网膜血管内皮细胞中的表达情况，这可能是导致结果差异的原因；本次试验中发现miR-132含量在糖尿病视网膜病变患者血浆内含量相对较低，导致循环荧光域值(CT值)较大，PCR结果可能存在误差，因此后续试验需要进一步更为精确的检测方法。有研究表明，在DR中MAPK1/3信号通路对视网膜血管损伤和视网膜神经节细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的释放有关键调节作用[20]。同时，MAPK3/1与DR病变的发生、发展密切相关，与视网膜神经节细胞凋亡有关。而miR-132对小鼠胚胎视网膜神经节细胞的生长有促进作用[13]。那么miR-132与MAPK1/3信号通路在DR发展中的具体作用及对视网膜神经节细胞的保护作用机制，我们将通过对高糖诱导的视网膜神经节细胞进行进一步的深入研究。