杂交链反应在超灵敏检测方面的应用进展*

赵云虎，覃晓琳，杨结仪，陈文韬，廖仪文 综述,郑和平△ 审校

(1.安徽医科大学，安徽合肥 230000；2.广东省皮肤病医院检验科，广东广州 510000)

现代医学领域，许多疾病的诊断和治疗都依赖一定的检测技术，无论是分子水平的核酸和蛋白质，还是细胞水平的分析都需要高灵敏度高特异度的技术来提高检测的准确性。目前，临床常用的检测手段主要包括核酸扩增，免疫荧光，化学发光，比色法，免疫层析，酶免疫，直接镜检等，其中核酸扩增被认为是高灵敏高特异的检测技术之一[1]。现在的核酸扩增技术已经非常完善，主要分为两大类：热循环扩增和等温扩增。热循环扩增包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)等；等温扩增包括滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)，杂交链反应(HCR)等[2-5]。相对于热循环扩增，等温扩增外部条件要求更简单，不需要额外的仪器辅助变温，甚至可以在室温下反应，其中以HCR为基础的等温扩增得到人们的广泛关注[6]。

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR，一种无酶、高敏、简单、高效能、不依赖仪器的等温扩增技术。HCR是通过一段核酸引发物(NI)使两条发夹DNA(H1、H2)互相杂交的级联反应，形成稳定的长双链DNA，通常由几十个甚至上百个重复单位(H1、H2)互补配对形成，对H1、H2进行标记可实现检测信号的增强或放大，如荧光标记、电化学标记、纳米粒子标记等[8-10]。迄今为止，HCR已经应用于多种靶目标的超灵敏检测，包括核酸、蛋白质，甚至在肿瘤细胞中也有一定的应用[11-16]。除了靶目标的检测，HCR还可以联合识别分子，实现原位或细胞内成像，应用于疾病的诊断和治疗[17-18]。本文首先介绍了HCR的基本原理和设计原理，然后从核酸检测、蛋白检测、细胞检测及生物成像等方面介绍了HCR的应用进展。

1 HCR基本原理

2004年，DIRKS等[7]首次提出HCR的基本概念，利用DNA与基质的结合，同时进行识别和信号放大作用的创新性技术。HCR主要是通过一段核酸引发物(NI)识别并引起发夹核苷酸(H1、H2)互相杂交，形成长双链DNA的串联级联反应。H1由a、 b、 c、b′构成，H2由c′、b、a′、b′构成(H1、H2先经高温变性冷却后形成发夹结构)，NI由b′、a′构成。当NI不存在时，H1、H2可保持稳定；当NI存在时，通过互补配对与H1末端结合，打开H1发夹，暴露c、b′。暴露部分与H2末端互补，打开H2发夹暴露a′、b′(与NI序列相同)，从而持续打开H1和H2进行HCR，形成长双链DNA。DIRKS等[7]指出HCR产物的长短与加入NI量成反比。

2 HCR设计原理

常规的NI设计，可根据靶核酸序列选择其某段特异性单链序列，一般为24 bp(前18 bp为b′，后6 bp为a′)；H1一般为48 bp，根据NI互补序列获得a、b、b′序列，其环结构c需额外设计；H2与H1一样长，可通过H1互补序列和NI获得c′、b、a′、b′[19]。MITI等[20]在常规的HCR设计原理的基础上，描述了另一种自组装反应触发特定核酸靶标，用于检测不同核酸溶液中的靶目标，极大的提高了灵敏度。设计过程中需要遵守一些原则[21]：(1)末端(a、c′)的GC比例应在30%～40%以下；(2)末端长度应在12 bp以下，否则会影响发夹结构的稳定性；(3)茎长度(b、b′)应大于末端长度以保持发夹结构的稳定性；(4)发夹序列(H1、H2)总体的GC比例应大于60%。

3 HCR的应用

与传统的PCR相比，HCR是一种等温的、无酶的扩增技术。HCR和PCR主要不同点在于，HCR是一种引物扩增而PCR是一种产物扩增技术[22]。因此，HCR可以有效地减少非特异性扩增，减少假阳性结果，降低交叉污染，提高检测灵敏度。

3.1核酸检测 核酸是疾病早期诊断中特异的标志物，高敏高特异检测核酸对临床的诊断和治疗具有极大的意义。SONG等[8]利用β-CD对芘的荧光增强及靶DNA引发HCR，实现了靶DNA无酶高灵敏检测。其中，芘标记H2为信号源，由于β-CD与带负电荷的H2存在很强的静电作用，芘较容易进入β-CD腔，因此荧光信号明显增强。而当靶DNA存在时，H2参与HCR形成长双链DNA，由于空间位阻作用使芘难以进去β-CD腔，因此荧光信号弱，其检测限可达0.1 nmol/L。LU 等[23]通过HCR触发的酶级联反应建立了一种超灵敏比色法，H1和H2上分别标记葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP),经HCR提高了GOx/HRP的催化作用，实现了对靶DNA最低检测限达5.2 fmol/L。MA等[11]利用DNA修饰胶体金作为捕获探针，通过与靶DNA互补结合，暴露末端引发H1/H2级联反应。此时胶体金表面的长双链DNA可以抵抗盐离子诱导胶体金的聚集作用，使得溶液呈红色。反之，若不存在靶DNA，HCR不能发生，盐离子诱导使胶体金聚集呈蓝色。此方法具有超高灵敏度和特异度，检测限可达0.5 nmol/L。

HCR同样可应用于固相支持物表面，如电极，玻片，纳米粒子，微孔，微流体等，将分析物同复杂的样品体系分开。 YING等[12]用FAM标记捕获探针，靶DNA引发生物素化H1/H2(Bio-H1,Bio-H2)级联反应，HCR产物与样品垫上的亲和素化胶体金(AuNP-SA)结合，层析时被检测线上包被的FAM抗体捕获，可直接观察阳性结果。检测限低至1.76 pmol/L，比没有HCR扩增的层析低约2个数量级。CHEN等[9]把自催化链置换扩增(ASDA)与HCR巧妙的结合，可进行无标记和多重放大检测核酸。ASDA期间，利用DNA聚合酶和内切酶对固定发夹探针和辅助DNA链的连续聚合、切开，回收大量中间DNA序列，从而催化链置换扩增。同时，ASDA产物与H1/H2进行HCR，形成富含胞嘧啶环的长双链DNA，从而增多银纳米的聚集，增强电化学信号，其检测限可达0.16 fmol/L。

3.2蛋白质检测 蛋白质同样也是疾病诊断中重要的标志物，然而在临床样本中许多靶蛋白的丰度偏低，因此高敏高特异检测靶蛋白同样也是人们关注的重点。CHOI等[24]以荧光标记H1/H2，通过与抗体偶联的NI进行HCR，检测单核细胞分泌的细胞因子和趋化因子。相对于无HCR的免疫荧光，免疫-HCR的检测限和灵敏度提高近200倍。HOU等[13]将抗体和NI同时包被于纳米金上形成Ab-AuNP-NI复合物，具有多个NI引发部位，可引发多个HCR产物包被于同一个纳米金上，通过电化学信号检测癌胚抗原(CEA)，线性范围为1.0 pg/mL～20.0 ng/mL，检测限可达0.42 pg/mL。XU等[14]将纳米碳标记H1/H2，与检测抗体偶联的NI引发HCR，通过HCR放大效应及金属增强荧光(MEF)构建了一个双扩增荧光传感器检测甲胎蛋白(AFP)，线性范围为0.000 5～5 ng/mL，检测限可达94.3 fg/mL。

除了抗体外，适配体也能够高亲和高特异识别靶蛋白。适配体是一种短链单链DNA或RNA，因此可作为NI参与HCR，用于检测蛋白质。 WANG等[25]利用氧化石墨烯(GO)对ssDNA和dsDNA的亲和性不同，分离H1/H2和HCR产物，从而提高检测灵敏度。当靶蛋白存在时，适配体识别靶蛋白并改变自身构象，引发H1和H2级联反应形成长双链DNA。而GO分离作用纯化了HCR产物，通过荧光染料SYBR Green结合双链DNA小沟，达到提高灵敏度的效果，该方法的检测限可达1.25 pmol/L。 NIE等[26]通过适配体识别被磁珠抗体捕获的卵巢癌标志物CA125抗原，适配体引发纳米金标记H1和游离H2形成树枝状的长链，再利用钼酸根与DNA磷酸酯基团的氧化还原反应，大量的磷酸集团增加了电化学信号，使得检测灵敏度显著增强，检测限可达50 μU/mL。

3.3肿瘤细胞检测 肿瘤细胞的某些分子标志物的表达水平与正常细胞有很大的不同，通过检测这些差异性表达的标志物有利于临床早期诊断和治疗癌症。LI等[15]针对胃癌患者血清中microRNA-21设计H1/H2，当microRNA-21存在时引发HCR，并通过SYBR GreenⅠ染料插入HCR产物作为信号，建立了无标记荧光检测模型，具有强荧光密度。其线性范围为1～105fmol/L，miRNA检测限可达0.255 4 fmol/L。YANG等[27]利用Au-S键将捕获探针固定在金电极表面，探针、靶DNA和(NI)杂交形成“三明治”结构，然后NI引发HCR形成长双链DNA，最后通过RuHex与长双链DNA的静电吸附作用产生电化学信号的改变。这种以HCR为基础的电化学物传感器可以精准的检测I型乳腺癌基因，检测灵敏度低至1 amol/L。

已有研究表明，可通过直接检测肿瘤细胞膜表面分子标志物来诊断癌症，有效的避免了裂解细胞和提取靶目标以检测核酸和蛋白，提高了检测的效率。ZHANG等[28]先将适配体序列(DNAa)和信号DNA(DNAb)部分互补杂交，当靶细胞存在时，适配体特异性识别肿瘤细胞表面分子，构象改变使DNAb游离。DNAb可引发H1/H2级联反应，形成长双链DNA可作为强荧光效应的铜粒子(CuNPs)的载体，从而实现了无酶定量检测肿瘤细胞，其检测限达50个细胞。ZHOU等[16]先将捕获探针修饰到金电极表面，适配体通过部分互补的(NI)进行HCR，HCR中的H1和H2经特殊设计，形成的长双链DNA含有许多分支序列，该分支序列与捕获探针完全互补，因此提供了大量的捕获位点。当肿瘤细胞存在时，经适配体的特异性识别及分支序列和捕获探针互补杂交作用，可超灵敏捕获肿瘤细胞，检测乳腺癌MCF-7细胞的检测限可达4个细胞。

3.4生物成像 荧光原位杂交(FISH)是通过识别细胞或组织内的靶RNA，直接观察RNA的表达量和分布，以阐明相关病理过程和临床诊断。然而单个荧光标记探针的荧光强度较弱,CHOI等[29]通过荧光标记H1/H2进行HCR-FISH，HCR产物能提供大量的荧光信号，HCR-FISH比FISH的荧光强度增强近200倍。YAMAGUCHI等[30]比较HCR-FISH与CARD-FISH和标准FISH检测环境中的微生物，认为HCR-FISH不但具有高特异性的强荧光信号，其检出率也优于其他的FISH，可用于单个微生物细胞检测。 HUANG等[31]利用荧光共振转移(FRET)结合HCR-FISH的方法，避免了FISH中反复冲洗的过程，消除了探针积累或退化引起的假阳性信号。主要通过3个发夹结构(H1、H2、H3)的相互作用产生FRET信号，其中H2/H3两端均标记TAMRA和FAM，H1识别靶mRNA后暴露末端引发H2/H3介导的HCR，从而增强FRET信号，操作简单易行，节约时间。

除了应用于FISH成像，HCR还可以运用于活细胞成像。WU等[32]将FAM和TMR分别标记在H1/H2上，再包被于肽化纳米金形成复合体，复合体可通过胞吞作用进入胞内。由于TMR的荧光吸收使胞内仅有很弱的荧光信号，当靶mRNA存在时，引发HCR使H1/H2与纳米金分离，恢复FRET信号并增强细胞内成像。OU等[17]利用MnO2载体吸附H1/H2并送入活细胞内，MnO2被胞内谷胱甘肽降解，释放H1/H2。然后通过胞内miRNA触发HCR，HCR产物上每两个FAM和一个TAMRA靠近产生显著增强的DD-A FRET信号，检测限高达9.8 pmol/L。LIU等[18]报道了一种分枝HCR用于活细胞内mRNA的高效信号放大成像，分枝HCR能够通过单个NI引发的分枝产物定位活细胞中单个靶分子，结果显示强烈的荧光斑点，其检测限可达500 fmol/L。ZHANG等[33]把端粒酶引物序列和HCR引发物组成复合体，并转染到细胞质中。当端粒酶存在时，复合物被识别，产生大量的NI，然后与H1/H2形成具有大量侧链的长双链DNA，可被复合物Q识别，产生增强信号，用于检测细胞裂解物中的端粒酶活性，检测限可达578个细胞/100μL。HUANG等[34]利用链霉亲和素结合生物素化的H1/H2，分别形成发夹DNA四联体，其中H1携带Cy3，H2携带Cy5。两个四联体均可高效的进入细胞内，并形成交联网络状结构，可特异性识别靶miRNA，极大地提高了灵敏度和空间分辨率，同时利用FRET的双发射比率成像，有效降低假信号的干扰。

4 小 结

通过以上综述可以看出，无酶等温扩增的HCR已广泛地应用于检测、成像和生物医学，但HCR的应用仍面临许多挑战。合适的H1/H2是HCR中的关键因素，H1/H2设计不完善可能会导致HCR失败，而目前仍缺乏公认的系统性发夹结构设计指南。由于以核酸形式存在的适配体能够识别蛋白质、小分子及细胞，极大地促进了HCR的发展，然而可供选择的适配体不多，极大地限制了适配体-HCR体系。对于在固相支持物表面采用HCR，如何控制核酸探针的密度和方向是目前需解决的难题之一，否则易导致非特异性吸附和集群效应，限制HCR的效能。在生物成像和生物医学方面，由于核酸的大小和电荷作用，携带成像试剂或治疗药物的HCR产物难以进入胞内，仅有少量的适配体可通过胞吞进入胞内，极大的限制了胞内成像和靶向治疗。另外，高分子量的HCR产物对正常细胞有一定的非特异性吸附，可能会造成假阳性信号或杀死正常细胞和组织，而且胞内对靶向药物缺乏有效和精准的释放机制，以至于降低治疗效果。现如今，以HCR为基础的应用多停留在实验室阶段，其实际应用仍然是个挑战，进一步研究HCR需建立在临床应用的基础上，简单而灵敏的POCT可作为未来研究HCR的方向之一。

尽管面临许多挑战，但无酶等温扩增的HCR体系能够综合各种各样的纳米材料、复合物和分析技术，促进DNA纳米技术的发展，加强这些方法在临床诊断、治疗、防控等方面的实际应用。