黑姜抗氧化活性研究

宗宁宇，王春亮，张志国＊，黄珊

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，济南 250353；2.山东和盈机械科技有限公司，山东 诸城 262200）

姜，属姜科，草本植物姜的根茎，多年生，又名百辣云、因地辛、姜根，其根茎肉质肥厚，形状如掌［1，2］。姜具有辛辣味和浓郁的芳香味，是一种常见的香辛调味料。姜原产于东南亚热带地区，在我国中部、东南部至西南部各省均有种植，山东莱芜、湖南新邵、四川宜宾等地均是姜的主要产区［3，4］。姜是一种药食两用植物，研究表明姜具有抗氧化、抗肿瘤、保肝利胆、消炎止痛、降血脂等多种生物活性［5－8］。黑姜，是以新鲜姜为原料，在一定的温度和湿度的条件下，发酵而成的一种新型姜制品。其中在加工黑姜的过程中，黑姜自身的组织遭到破坏，其物质发生一系列化学反应，包括酶促反应和非酶褐变反应，具体如美拉德反应、焦糖化反应等［9］。黑姜经发酵后，成分和功能上都发生了一些变化，营养成分和更强的生理活性更加丰富［10］。本文分别对黑姜的抗氧化活性进行了研究，通过测定其水提物和醇提物清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力、清除OH自由基能力和铁还原能力，同时以芦丁为阳性对照，测定了新鲜未经处理的姜的醇提物和水提物的抗氧化活性，与黑姜进行对比。目前，国内外对黑姜的活性研究鲜有报道，本文通过对黑姜的抗氧化活性研究，以期为姜的开发利用提供一些理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁标准品：购自索莱宝生物科技有限公司，DPPH（1-二苯基-2-三硝基苯肼）：购自上海如吉生物科技发展有限公司；ABTS（2＇-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、TPTZ（2，4，6-三吡啶基三嗪）：购自安徽博美生物科技有限公司；无水乙醇：购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电热恒温鼓风干燥箱 广州市汉迪环境试验设备有限公司；可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；低速离心机 张家港市南洋机械有限公司；水浴锅 常州中捷实验仪器制造有限公司；旋转蒸发仪 郑州凯祥仪器设备有限公司；超声仪 上海生析超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

分别准确称取样品50g，置于蒸馏水和70%乙醇（料液比为1∶10）中于40℃ 水浴浸提4h后，超声浸提30min。将浸提液过滤、离心，滤渣按上述方法重复浸提2次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩后，再通过真空冷冻干燥。干燥后的样品称重，并配成所需浓度的样品液。

1.3.2 DPPH自由基清除实验

分别取不同质量浓度的样品溶液1.0mL，依次加入2.0mL 0.1mmol／L的DPPH 乙醇溶液中，暗处室温反应30min，在波长517nm处的吸光度为A1，以无水乙醇溶剂作空白对照，测量其在波长517nm处的吸光度（A0）。测定2.0mL无水乙醇溶液与1.0mL样品液混合后在波长517nm处的吸光度（A2），以芦丁作阳性对照，每组做3个重复，求其平均值［11，12］。

DPPH自由基清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.3 ABTS自由基清除实验

ABTS自由基溶液的制备：将ABTS和K2S2O8混合，并确保它们的最终浓度分别为7.0，2.5mmol／L，之后将混合液置于室温暗处反应12～16h。实验之前，将其用pH为7.4的磷酸盐缓冲液进行稀释，直到稀释液在波长734nm条件下的吸光度值为0.7左右，制成ABTS自由基工作液。

在试管中加入1.0mL不同质量浓度的样品溶液，再加入2.0mL的ABTS自由基工作液，摇匀使其充分混合，在室温下反应6min后，在波长734nm条件下测定其吸光度（A1），以蒸馏水为空白对照测量其吸光度（A0），测定2.0mL磷酸盐缓冲液，1mL样品液反应，吸光值为A2。以不同质量浓度的芦丁溶液作为阳性对照，每组做3个重复，求其平均值［13，14］。

ABTS自由基清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.4 OH自由基清除实验

向试管中分别加入不同质量浓度的样品溶液2.0mL，然后分别加入1.8mmol／L 硫酸亚铁溶液2.0mL和1.8mmol／L水杨酸-乙醇2.0mL，最后加入双氧水（0.03%）0.1mL用以启动反应，用振荡器混合均匀，于37℃水浴保持30min，在波长为510nm下测量各自的吸光度A1，用蒸馏水代替样品所得到的吸光度为空白对照A0，以无水乙醇代替水杨酸-乙醇溶液的吸光度A2，并用芦丁代替样品作阳性对照，每组做3个重复，求其平均值［15，16］。

清除率（%）＝［1－（A1－A2）／A0］×100。

1.3.5 FRAP（ferric reducing antioxidant power）评估方法

FRAP试剂的制备：300mmol／L醋酸缓冲液（pH 3.6）、10mmol／L TPTZ（加入40mmol／L盐酸）和20mmol／L FeCl3溶液，按10∶1∶1混合。

取100μL待测样品，加入3.6mL FRAP试剂、360μL蒸馏水，充分混匀，于37℃水浴反应60min后于593nm处测定吸光度，以不同质量浓度的芦丁溶液作为阳性对照，每组做3个重复，求其平均值［17，18］。

1.3.6 数据分析

通过Excel建立数据库，每个样品进行3次重复试验，试验所得数据均为3次试验的平均值，用Origin 8.0软件对数据进行统计分析与图表绘制。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除实验

DPPH自由基清除实验是测定体外抗氧化活性最常用的方法。DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种在氮氮连接键上含有不对称价电子的氮族自由基，它能稳定存在，于517nm处有最大吸收值，易于具有氢键供体的化合物发生电子转移反应［19］。

图1 姜的DPPH自由基清除率结果Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of ginger

由图1可知，黑姜醇提物清除DPPH自由基的能力最高，其IC50是0.12mg／mL，是鲜姜水提的2倍多。黑姜水提物的IC50是0.21mg／mL，黑姜醇提物的DPPH自由基清除率要高于水提物的清除率。在相同提取条件下，黑姜的DPPH自由基清除率要高于黄姜的清除率。

2.2 ABTS自由基清除实验

ABTS［2，2′-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐］自由基阳离子清除实验是根据不同浓度受试物对ABTS自由基阳离子溶液吸光度的影响，测定天然产物对ABTS自由基阳离子的清除能力［20］。

图2 姜的ABTS自由基清除率结果Fig.2 ABTS free radical scavenging rates of ginger

由图2可知，提取物对ABTS自由基的清除能力高于DPPH自由基的清除率，但整体趋势与DPPH自由基清除率相同。黑姜醇提物的清除能力，其IC50是0.04mg／mL，低于阳性对照芦丁的清除率，随着浓度的升高，清除能力增强。鲜姜水提物清除率最低，其IC50是0.23mg／mL。另外，鲜姜醇提物、黑姜水提物的IC50分别是0.09，0.11mg／mL。

2.3 OH自由基清除实验

OH自由基是生物细胞内反应活性最强的氧族自由基，可由超氧阴离子和过氧化氢在金属离子的作用下产生，对羟自由基清除能力的测定，通常采用水杨酸竞争捕捉羟自由基的方式进行测定［21］。

图3 姜的OH自由基清除率结果Fig.3 OH radical scavenging rates of ginger

由图3可知，相对于ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率，在同等浓度条件下，对OH自由基的清除能力最低，在所测浓度范围内，只有阳性对照芦丁的清除率达到50%。黑姜醇提物的清除率最高，当样品浓度为0.5mg／mL时，OH自由基清除率为36.49%，鲜姜水提物在浓度为0.5mg／mL时，清除率为16.09%。

2.4 FRAP评估方法

图4 姜的二价铁离子还原力比较结果Fig.4 Comparison results of ferrous ion reducing power of ginger

FRAP的原理是基于氧化还原反应的比色法以非酶抗氧化剂为还原剂，将氧化物质还原，从而起到抗氧化的作用。具体是在酸性条件下，Fe3＋-TPTZ被抗氧化剂还原成 Fe2＋-TPTZ，Fe2＋-TPTZ在593nm 处有强吸收峰［22，23］。

FRAP法测得的吸光度与抗氧化能力呈正相关，吸光值越低，铁还原能力越强，抗氧化活性越高。由图4可知，黑姜醇提物的铁还原能力最强，鲜姜水提物的铁还原力最弱，总体趋势为黑姜醇提物＞黑姜水提物＞鲜姜醇提物＞鲜姜水提物。

3 结论

综上所述，黑姜具有良好的抗氧化活性，与新鲜姜相比，抗氧化活性增强。2种不同提取方式所得的样品抗氧化活性不同，醇提物的抗氧化效果要优于水提物的抗氧化活性。4种抗氧化指标的大体趋势相同，其中黑姜醇提DPPH自由基清除率，其IC50是0.12mg／mL，ABTS自由基清除率，其IC50是0.04mg／mL，OH自由基清除率是鲜姜水提物的2倍多，铁离子还原力是鲜姜水提物的3倍。