利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究

董玉凤 王旭静 宋亚亚 靳 茜 王志兴,*



利用基因拆分技术培育耐草甘膦转基因水稻的研究

董玉凤1王旭静1宋亚亚1靳 茜2王志兴1,*

1中国农业科学院生物技术研究所 / 农业农村部农业转基因生物安全评价(分子)重点实验室, 北京 100081;2保定学院, 河北保定 071000

耐除草剂转基因水稻基因飘流可能产生的环境安全问题是人们关注的焦点之一, 并已成为耐除草剂转基因水稻能否在我国生产上发挥效益的限制因素。基因拆分技术能够有效地控制转基因目标性状飘流, 为培育耐除草剂转基因水稻提供新的途径和思路。本研究将耐除草剂基因拆分成N端(EPSPSn, 1~295 aa)和C端(EPSPSc, 296~435 aa), 分别与DnaE蛋白内含肽的N端(Intein-N)和C端(Intein-C)连接形成融合基因与, 并分别通过农杆菌介导法转入受体材料中花11。Southern杂交证明转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因为单拷贝插入。侧翼序列分析证明转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因分别插入第2和第6染色体。利用四引物法筛选出转基因水稻En-12和Ec-22的纯合系, 并通过有性杂交获得同时含有与的转基因水稻En×Ec。草甘膦抗性分析发现, 单独含有1个基因片段的转基因水稻En-12和Ec-22不具有耐受草甘膦特性, 而同时含有2个基因片段的转基因水稻En×Ec具有耐受草甘膦的特性, 说明拆分后的2个蛋白片段在intein的介导下重新组装成完整有功能蛋白, 并赋予转基因水稻耐受草甘膦的特性。转基因水稻En×Ec与含有完整转基因水稻G2-6相比, 其耐受草甘膦的能力有所下降, 但能够满足生产需求。本研究结果为利用基因拆分技术培育转基因耐草甘膦水稻提供了科学依据, 同时也为利用基因工程手段培育转基因杂交稻提供了新的技术平台。

耐草甘膦; 转基因水稻; 基因拆分技术

稻田杂草与水稻竞争水、肥、空间和传播病虫害而对水稻产量和品质产生影响。在劳动力匮乏、人工成本逐年增加的情况下, 化学除草因省工省力等优点而被广泛应用。稻田杂草种类比较多, 选择性除草剂如 50% 优克稗乳油和幼禾保等只能对某一类杂草起作用, 无法达到完全控制杂草的效果。草甘膦为广谱灭生性和内吸传导型除草剂, 能杀死全部杂草, 但同时对水稻也具有灭杀作用。因此, 稻田中使用草甘膦的前提是培育抗草甘膦的水稻品种。

基因工程技术的发展为培育抗草甘膦水稻提供了新途径, 并取得了一些进展。研究者们通过将不同的耐草甘膦基因导入水稻, 获得了具有不同草甘膦耐受性的转基因水稻新种质[1-5]。但同时也引发了人们对其安全性的关注, 关注的焦点问题之一是耐草甘膦基因通过花粉介导飘流至有性可交配野生种或杂草后, 是否会演变为难以防治的“超级杂草”[6], 对生物多样性产生一定的影响。目前普遍认同的防控转基因飘流的主要方法是物理隔离, 在出台的农业转基因生物安全管理条例和农业转基因生物安全评价管理办法中, 规定了转基因水稻的隔离距离为100 m, 这在我国小农经济的国情下, 实施起来具有一定的困难, 并提高了研发成本。基于内含肽的蛋白质转剪接功能建立起来的基因拆分技术为培育抗草甘膦转基因水稻提供了新的思路, 利用此方法培育的转基因水稻能有效防控耐草甘膦性状向有性可交配物种的转移, 避免因基因飘流可能带来的生态风险。

基因拆分技术是建立在蛋白内含肽(Intein)及其介导的蛋白转剪接的基础上发展起来的, 简单说就是将目的基因拆分成两个基因片段, 分别与Intein两个剪接域的基因序列结合, 形成融合基因, 翻译后形成的两个融合蛋白通过Intein介导的蛋白转剪接功能, 将Intein从前体蛋白中切除, 同时将两个基因片段编码的蛋白序列连接起来, 形成一个完整的、有功能的蛋白。sp. PCC6803 DnaE Intein (DnaE Intein)是第一个发现的天然存在的 trans-splicing intein, 它存在于编码复制 DNA 聚合酶III的催化亚基a的DnaE基因中, 有123个氨基酸残基的In (Intein N端)和36个氨基酸残基的Ic (Intein C端)两个片段组成, In和Ic间插入了745 kb的DNA间隔区域[7]。与人工合成的Intein相比,DnaE Intein 催化的蛋白剪接反应有效率高和反应条件温和等特点, 且DnaE Intein片段In和Ic离体条件下不经尿素处理也能进行剪接[8]。实验证明DnaE Intein在离体、活体条件下均能进行蛋白质的剪接反应, 使分开的两个基因片段表达后的蛋白片段重新组装成有功能的完整蛋白质[9]。目前已在烟草、拟南芥、小麦等作物中证明拆分后的目标基因能够在DnaE intein介导下重新组装成完整有功能蛋白[10-16]。

基因克隆自极端草甘膦污染环境, 转棉花、烟草、玉米、水稻等对草甘膦有较高的抗性[17-20]。G2-aroA蛋白在F295/S296的位置拆分后, 通过DnaE intein介导能重新组装成完整有功能蛋白[21-22]。本研究利用和DnaE intein的蛋白转剪接功能, 培育出了有效降低功能基因飘流频率的耐草甘膦转基因水稻。此研究不但为耐草甘膦转基因水稻的研发提供了新种质, 也为培育杂交转基因水稻提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

水稻转化所用受体材料中花11 (ZH11)和转完整基因水稻G2-6为本实验室保存。植物表达载体13UEI [含有基因的N端(1~295氨基酸的编码序列) EPSPSn和DnaE Intein的N端结构域In的融合基因片段]和13UIC [含有基因的C端(296~445氨基酸的编码序列) EPSPSc和DnaE Intein的C端结构域Ic的融合基因片段Ic-EPSPSc]为本实验室构建。农达(Roundup)购自Monsanto公司; 其他分析纯化学药品、抗生素以及激素等购自拜尔迪公司。本研究所用引物见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻遗传转化 采用热激法将含有不同融合基因片段的植物表达载体13UEI和13UIC质粒分别转化根癌农杆菌 EHA105, 依据已报道的农杆菌介导法遗传转化水稻品种中花11[23]。

1.2.2 转基因水稻的拷贝数分析 利用CTAB法提取转基因水稻叶片基因组DNA。基因组DNA经RI或dIII酶切, 酶切产物用于Southern杂交分析。按照地高辛标记试剂盒(DIG High Primer DNA Labeled and Detection Starter Kit II, Roche)说明书进行Southern杂交。参照PCR法标记地高辛探针的试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit, Roche)说明书进行探针标记, 其中EnIn535F/ EnIn535R用于克隆检测基因的探针, IcEc459F/IcEc459R用于克隆检测基因的探针。

表1 实验所用引物

1.2.3 转基因水稻的侧翼序列分析 用CTAB 法提取水稻基因组DNA, 根据植物表达载体13UEI 和 13UIC上T-DNA左边界附近的潮霉素筛选标记基因设计3个用于特异引物hptII-tail-1、hptII-tail-2、hptII-tail-3 以及用于检测扩增条带特异性的 hptII-text-323, 利用染色体步移技术克隆侧翼序列, 具体操作参照试剂盒(Genome Walking Kit, TaKaRa)说明书。根据获得的侧翼序列和公布的水稻基因组序列, 设计引物12-RF和22-RF, 根据T-DNA右边界附近序列设计引物RB-R, 利用同源克隆的方法获得另一侧的侧翼序列。

1.2.4 转基因水稻纯合系筛选 依据转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因在水稻基因组中的整合位点序列和T-DNA插入序列, 分别设计12-TF/12-TR、22-TF/22-TR、12-OsF/12-OsR和22-OsF/22-OsR引物对, 利用12-TF/12-TR和12-OsF/12-OsR 两对特异引物对转基因植株En-12进行PCR检测, 利用22-TF/22-TR和22-OsF/22-OsR两对特异引物对转基因植株Ec-22进行PCR检测, 筛选出En-12和Ec-22的转基因纯合系。

1.2.5 转基因水稻的草甘膦抗性分析 1)叶面喷施法: 水稻三至五叶期, 田间喷施2000 mg L–1的草甘膦, 10 d后观察植株的生长情况。同时在室内将转基因水稻En-12×Ec-22以及非转基因对照中花11的种子消毒并催芽, 均匀地种植在8 cm × 8 cm培养钵中, 三至五叶期开始喷施不同浓度的草甘膦。在喷施当天和喷施后12 d测量株高, 使用SPSS 19.0软件统计分析喷施前后水稻株高与叶片生长速率, 评定毒害效果, 并使用Graph Pad 6.0软件绘图。2)水培法: 将水稻种子消毒后在4℃黑暗条件放置2 d, 而后37℃黑暗培养。待种子冒白后轻轻移入去除底部的96孔板中, 放于含有不同浓度草甘膦的 1/2 Yoshida培养液(1 mmol L–1NH4NO3, pH 5.5)中培养10 d, 每天更换营养液一次。所有水培植物在人工气候室内生长(14 h/10 h光照/黑暗, 光子流量密度500 μmol m–2s–1PAR, 相对湿度为90%)。在不同浓度草甘膦浓度培养状态下, 植物地上部株高可直接反应植物对草甘膦的耐受性。每个样品处理的植株数为30~40株。在草甘膦抗性分析过程中, 为了去除En-12抗性分析过程中中的伪杂种, 喷施草甘膦之前提取样品的叶片DNA, 利用22-TF/22-TR和12-TF/12-TR对En×Ec进行PCR检测, 依据检查结果拔除伪杂种。

1.2.6 转基因水稻的RT-PCR检测 提取水稻总 RNA 并反转录成 cDNA, 以cDNA为模板, 以外源目的基因特异引物En535F/En535R、Ec459F/Ec459R、内标基因特异引物对sps155-F/sps155-R进行PCR检测, 反应程序为98℃预变性10 min, 94℃ 1 min, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 30个循环, 72℃ 延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 含有单个基因片段转基因水稻En-12和Ec-22 的选育

将分别含有和融合基因的植物表达载体13UEI和13UIC通过农杆菌介导法转化水稻中花11, 获得含有的转基因水稻En 52株, 含有的转基因水稻Ec 46株(图1和图2)。Southern杂交证明转基因水稻En-12和Ec-22为外源基因单拷贝插入(图3)。

图1 水稻转化用植物表达载体中外源基因表达盒示意图

Plasmid: 转化载体的名称; Transgenic plant: 转基因水稻的名称; UbiP: 玉米多聚泛素蛋白基因Ubiqutin启动子; CTS: 菊花Rubisco小亚基的叶绿体信号肽; NosT: 胭脂碱合酶基因Nos的终止子; 35SP: 花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子;: 潮霉素磷酸转移酶基因; PolyA Signal: 多聚腺苷酸加尾信号; GUSA: β-葡萄糖苷酸酶基因; Nos PolyA: 来自于Nos基因的多聚腺苷酸加尾信号; RB: T-DNA右边界; LB: T-DNA左边界。

Plasmid: Construct names; Transgenic plant: the name of different transgenic rice; UbiP: Ubiqutin promoter from maize; CTS: Rubisco small subunit chloroplast signal peptide from; NosT: nopaline synthase gene terminator; 35SP: Cauliflower mosaic virus CaMV 35S promoter;: Hygromycin phosphotransferase gene; PolyA Signal: Polyadenylation tail signal; GUSA: β-Glucuronidase gene; Nos PolyA: Polyadenylation tail from nopaline synthase gene; RB: T-DNA right border; LB: T-DNA left border.

图2 转基因水稻的PCR检测

上图: En检测。M: 5 kb DNA marker (5000 bp, 3000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 800 bp, 500 bp, 300 bp); 1~14: 转基因水稻; 15: CK-; 16: CK+。下图: Ec检测。M: 100 bp DNA marker (1500 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp); 1~14: 转基因水稻; 15: CK-; 16: CK+。

Up: For transgenic rice En detection. M: 5 kb DNA marker (5000 bp, 3000 bp, 1500 bp, 1000 bp, 800 bp, 500 bp, 300 bp); 1-14: Transgenic rice; 15: CK-; 16: CK+.Down: For transgenic rice Ec detection. M: 100 bp DNA marker (1500 bp, 1000 bp, 900 bp, 800 bp, 700 bp, 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp); 1–14: Transgenic rice; 15: CK-; 16: CK+.

图3 转基因水稻的Southern杂交

2.2 转基因水稻En×Ec的培育

利用染色体步移和同源克隆技术获得了转基因水稻En-12和Ec-22中外源基因整合位点的侧翼序列。序列分析发现: 在转基因水稻En-12中, T-DNA插入到水稻基因组第2染色体的31,252,771~ 31,252,833位置, 并造成插入位点处62 bp基因组DNA的缺失; 在转基因水稻Ec-22中, T-DNA插入到水稻基因组第6染色体的24,271,155~24,271,279位置, 造成第6染色体插入位点处缺失124 bp的基因组DNA (图4)。

由于基因分离, 转基因水稻后代中会同时存在非转基因、杂合体和纯合体3种类型。在转基因作物中外源基因插入位点明确的情况下, 四引物法能简单快捷地从后代中筛选出纯合系, 缩短筛选时间。在外源基因插入位点上游的水稻基因组上设计正向引物OsF和TF, 插入位点下游的水稻基因组上设计反向引物OsR, 在插入序列上设计一个中间引物TR, 利用OsF/OsR和TF/TR两个引物对可以从后代中鉴定转基因纯合系植株。纯合系中, 由于插入的T-DNA片段太长, OsF/OsR引物对无法扩增到目的DNA片段, 只有TF/TR能扩增到目的条带产物; 非转基因水稻中, 由于没有外源基因, OsF/OsR可以扩增出相应DNA条带, 但TF/TR不能扩增到目的条带; 杂合体一条染色体上存在外源基因, 另一条染色体没有外源基因, OsF/OsR和TF/TR均能扩增到相应的目标DNA条带(图5-A)。

图4 T-DNA转基因水稻En-12 和Ec-22插入位点分析

本研究根据En-12中外源基因插入位点处的侧翼序列设计了引物对12-OsF/12-OsR, 根据插入序列和侧翼序列设计了引物对12-TF/12-TR。用12-OsF/ 12-OsR和12-TF/12-TR对En-12后代进行PCR检测, 只有用12-OsF/12-OsR能扩增到548 bp左右的DNA条带的植株为非转基因, 只有用12-TF/12-TR引物能扩增到645 bp目的条带的植株为纯合系, 而用12-OsF/ 12-OsR和12-TF/12-TR能同时扩增到548 bp和645 bp DNA条带的为杂合系。利用此方法, 从T1转基因植株中获得了En-12纯合系植株。同时根据Ec-22中外源基因插入位点处的侧翼序列设计了引物对22-OsF/22-OsR, 根据插入序列中T-DNA右边界附近序列和侧翼序列设计了引物对22-TF/22-TR。用22-OsF/22-OsR和22-TF/22-TR对Ec-22后代进行PCR检测筛选, 从T1转基因植株中获得了Ec-22纯合系植株(图5-B, C)。利用筛选出的En-12和Ec-22纯合系植株为父母本, 通过有性杂交获得了同时含有和融合基因的转基因水稻En×Ec。

2.3 转基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性分析

对不同类型的转基因水稻田间喷施2000 mg L–1的草甘膦, 发现单独含有1个基因片段的En-12和Ec-22植株均枯萎死亡, 而同时含有2个基因片段的转基因水稻En×Ec生长正常, 具有耐受草甘膦的特性(图6-A)。在盆栽条件下, 对转基因水稻En×Ec、含完整基因的转基因水稻G2-6和中花11喷施不同浓度的草甘膦发现, 中花11喷施1000 mg L–1的草甘膦12 d后, 植株干枯死亡; 转基因水稻 En×Ec和G2-6 喷施1000 mg L–1草甘膦后能够正常生长, 转基因水稻En×Ec在喷施5000 mg L–1草甘膦后植株生长明显受到抑制, 而转基因水稻G2-6受抑制的程度低于转基因水稻En×Ec (图6-B)。RT-PCR检测发现, 当用 En535F/En535R和Ec459F/Ec459R进行多重PCR检测时, En×Ec中只能检测到(扩增片段大小为535 bp)和(扩增片段大小为459 bp) 2个基因片段的表达, 但未检测到完整基因(扩增片段大小为1201 bp)的表达, 说明拆分后的基因片段在intein介导下重新组装成有功能的完整蛋白(图7)。

图5 四引物法从T1代转基因水稻中筛选纯合系

A: 四引物法筛选转基因纯合系的引物设计示意图; B: En-12和Ec-22转基因纯合系筛选所需引物特异性检测. M: Trans2K DNA marker (2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); C: En-12和 Ec-22 后代 PCR 检测结果。En-12检测中编号为5、10和12的株系为纯合体; 1、4、6、7、8、9为杂合体; 2、3、11为非转基因水稻; Ec-22检测中编号为3、6、7、8、9、10、11、12的株系为纯合体; 1、2、4为杂合体, 5为非转基因水稻。

A: Primer design for selection of homozygous line using 4 primers method; B: Specific detection of primers for homozygous line selection of En-12 and Ec-22. M: Trans2K DNA marker (2000 bp, 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); C: PCR detection results of progeny of transgenic rice En-12 and Ec-22. For PCR detection of En-12: 5, 10, and 12 were homozygous lines; 1, 4, 6, 7, 8, and 9 were heterozygous lines; 2, 3, and 11 were non-transgenic rice. For PCR detection of Ec-22: 3, 6, 7, 8, 10, 11, and 12 were homozygous lines; 1, 2, and 4 were heterozygous lines; 5 was non-transgenic rice.

将转基因水稻En×Ec和受体材料中花11置于不同浓度的草甘膦水溶液中培养, 发现随草甘膦浓度的提高, 水稻地上部株高、根长与总鲜重均呈现逐渐下降的趋势; 受体材料中花11对草甘膦耐受性的拐点浓度(致死浓度)为1 mg L–1; 在0~10 mg L–1草甘膦浓度下, 转完整基因的水稻G2-6生长不受影响, 随草甘膦浓度的进一步提高, 转基因水稻的生长受到抑制, 对草甘膦耐受性的拐点浓度为100 mg L–1; 而转基因水稻En×Ec的地上部株高、根长及植株总鲜重在 0 和 5 mg L–1草甘膦浓度下无差异, 对草甘膦耐受性的拐点浓度为 25 mg L–1(图8)。上述结果说明转基因水稻En×Ec对草甘膦的耐受性低于转完整基因的水稻 G2-6。

3 讨论

转基因作物大面积商业化种植以来的20多年间, 耐除草剂一直是商业化应用转基因作物的主要性状[23]。耐除草剂转基因作物可能带来的环境安全问题, 尤其是基因飘流可能产生的环境安全问题也一直是人们所关注的焦点问题。在作为水稻发源地之一的我国, 如何避免转基因水稻基因飘流, 培育无目标性状向环境逃逸的转基因耐草甘膦水稻显得尤为重要。

图6 转基因水稻的草甘膦抗性分析(草甘膦浓度单位: mg L–1)

A: 转基因水稻的草甘膦抗性田间检测; B: 盆栽转基因水稻的草甘膦抗性分析。

A: Glyphosate tolerance analysis of transgenic rice in field; B: Glyphosate tolerant analysis of transgenic rice cultivated in pot.

图7 转基因水稻的RT-PCR检测

M: Trans2k DNA marker; 1: En535F/En535R扩增转基因水稻 En-12; 2: Ec459F/Ec459R 扩增转基因水稻 Ec-22; 3: En535F/ En535R和Ec459F/Ec459R 扩增转基因水稻 En×Ec; 4: sps155F/ sps155R 扩增转基因水稻En-12内标基因; 5: sps155F/ sps155R扩增转基因水稻Ec-22内标基因; 6: sps155F/ sps155R扩增转基因水稻En×Ec内标基因。

M: Trans2k DNA marker; 1:fragment (535 bp) was amplified from En-12 using En535F/En535R primer pair; 2:fragment (459 bp) was amplified from Ec-22 using Ec459F/Ec459R primer pair; 3:(535 bp) and(459 bp) fragments were amplified from En×Ec using En535F/ En535R and Ec459F/Ec459R primer pairs at same time. Nogene fragment (1201 bp) was amplified; 4: reference genefragment was amplified from En-12 using sps155F/ sps155R primer pair; 5: reference genefragment was amplified from Ec-22 using sps155F/sps155R primer pair; 6: reference genefragment was amplified from En×Ec using sps155F/sps155R primer pair.

基因拆分技术作为一种限控转基因飘流的生物学措施, 能够有效地控制转基因性状向可交配物种的转移, 大大降低对生态环境带来不利影响的可能性。在烟草人工杂交情况下证明, 利用基因拆分技术至少能降低草甘膦性状向非转基因烟草转移的75%[21]。本研究将具有我国自主知识产权的基因拆分后转化水稻, 证明拆分后的基因片段在intein介导下重新组装成完整有功能蛋白, 赋予了水稻耐受草甘膦的特性。此研究的成功不但为培育转基因耐草甘膦水稻提供了新方法, 而且为培育安全转基因杂交稻提供了新途径。此法将目标基因拆分成N端和C端两部分, 即片段A和B, 分别与intein的N端和C端剪接域的基因序列连接, 形成融合基因, 片段A导入亲本A中, 片段B导入亲本B中, 通过杂交获得同时含有2个基因片段的转基因杂交水稻。因此, 本研究也为培育抗除草剂提供了一个新思路。

对草甘膦的耐受性是决定所培育的转基因水稻能否走向市场的决定因素之一。因此, 本研究分析了转基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性, 发现其耐受性比受体材料提高，但与本实验室培育的含有完整的转基因水稻G2-6相比, 其草甘膦耐受性明显降低。分析其可能原因有以下几个方面, 一是两种转基因水稻中外源蛋白的表达量存在明显差异; 二是2个基因拆分后的重新组装效率影响了目标蛋白的表达量。拆分位点是影响基因拆分后的重新组装效率的主要因素。对于基因来说, 在190/191位氨基酸处拆分后分别转化烟草, 在DnaE intein介导下重新组装的 Cre 重组酶功效为野生型的77%[15]。而在232/233位氨基酸处拆分后分别转化拟南芥, 杂交后代中Cre的重组酶功效接近于野生型[24]; 三是因为基因拆分后的重新组装过程中导致酶活性或结构改变。Dun 等曾报道在原核生物中拆分后重新组装的G2-aroA蛋白的酶活性比完整G2-aroA蛋白的酶活性明显降低, 为完整G2-aroA蛋白酶活的62.92%[20]。另外, 使用除草剂后产量是否受影响也是衡量抗除草剂水稻应用潜力的一个重要标准。因此, 后期我们将进一步分析的其他可拆分位点、En×Ec转基因水稻的基因表达水平和产量性状, 明确转基因水稻 En×Ec 草甘膦耐受性低的原因和商业化应用的潜力。

图8 不同草甘膦浓度下的植株生长势分析

4 结论

耐草甘膦基因基因在295/296位氨基酸处拆分后, 在DnaE intein介导下在转基因水稻 En×Ec 中重新组装成完整有功能蛋白, 赋予耐除草剂特性, 但转基因水稻En×Ec的草甘膦耐受性低于转完整基因的水稻。

[1] Zhan T, Zhao T, Lin C Y, Shen Z C. Development of transgentic glyphosate-resistant rice withgene encoding 5-enolpyru­vy­shi­kimmate3-phoshate synthase.,, 10: 1307–1312.

[2] Chandrasekhar K, Reddy G M, Singh J, Vani K, Vijayakshmi M, Kaul T, Reddy K M. Development of transgenic rice harbouring mutated rice 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (Os-mEPSPS) andleaf agglutinin (ASAL) genes conferring tolerance to herbicides and sap-sucking insects., 2014, 32: 1146–1157.

[3] Chhapekar S, Raghavendrarao S, Pavan G, Ramakrishna C, Singh V K, Phanindra M L V, Dhandapani G, Sreevathsa R, Kumar P A. Transgenic rice expressing a codon-modified synthetic CP4- EPSPS confers tolerance to broad-spectrum herbicide, glyphosate., 2015, 34: 721–731.

[4] Cui Y, Huang S, Liu Z D, Yi S Y, Zhou F, Chen H, Lin Y. Deve­lopment of novel glyphosate-tolerantrice lines: a step toward commercial release., 2016, 7: 1218.

[5] Dong Y F, Jin X, Tang Q L, Zhang X, Yang J T, Liu X J, Cai J F, Zhang X B, Wang X J, Wang Z X. Development and event- specific detection of transgenic glyphosate-resistant rice expressing thegene., 2017, doi: 10.3389/ fpls.2017.00885.

[6] Kling J. Could transgenic super crops one day breed super weeds?, 274: 180–181.

[7] Wu H, Hu Z, Liu X Q. Protein trans-splicing by a split Intein encoded in a split DnaE gene ofsp. PCC6803., 1998, 95: 9226–9231.

[8] Yamazaki T, Otomo T, Oda N, Kyogoku Y, Uegaki K, Ito N, Ishino Y, Nakamura H. Segmental isotope labeling for protein NMR using peptide splicing., 1998, 120: 5591–5592.

[9] Evans T C Jr, Martin D, Kolly R, Panne D, Sun L, Ghosh I, Chen L X, Benner J, Liu X Q, Xu M Q. Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the DnaE gene of Synechocystis species PCC6803., 2000, 275: 9091–9094.

[10] Chin H G, Kim G D, Marin I, Mersha F, Evans Jr T C, Chen L X, Xu M Q. Protein trans-splicing in transgenic plant chloroplast: reconstruction of herbicide resistance from split genes., 2003, 100: 4510–4515.

[11] Yang J, Fox Jr F G, Henrysmith T V. Intein-mediated assembly of a functional beta-glucuronidase in transgenic plants., 2003, 100: 3513–3518.

[12] Gils M, Marillonnet S, Werner S, Grutzner R, Giritch A, Engler C, Schachschneider R, Klimyuk V, Gleba Y. A novel hybrid seed system for plants., 2008, 6: 226–235.

[13] Kempe K, Rubtsova M, Gils M. Intein-mediated protein assembly in transgenic wheat: production of active barnase and acetolactate synthase from split genes., 2009, 7: 283–297.

[14] Wang P, Chen T R, Sakurai K, Han B X, He Z G, Feng G P. Intersectional Cre driver lines generated using split-Intein mediated split-Cre reconstitution., 2012, 2: 497.

[15] Han X Z, Han F Y, Ren X S, Si J, Li C Q, Song H Y. Ssp DnaE split-intein mediated split-Cre reconstitution in tobacco., 2013, 113: 529–542.

[16] Ge X, D’Avignon D A, Ackerman J J, Duncan B, Spaur M B, Sammons R D. Glyphosate-resistant horseweed made sensitive to glyphosate: low-temperature suppression of glyphosate vacuolar sequestration revealed by 31 P NMR., 2011, 67: 1215–1221.

[17] Zhang X B, Tang Q L, Wang X J, Wang Z X. Structure of exogenous gene integration and event-specific detection in the glyphosate-tolerant transgenic cotton line BG2-7., 2016, 11: e158384.

[18] Liu Y J, Zhang Y W, Liu Y, Lu W, Wang G Y. Metabolic effects of glyphosate on transgenic maize expressing agene from., 2015, 24: 233–241.

[19] Guo B F, Yong G, Hong H L, Jin L, Zhang L J, Chang Z R, Lu M, Qiu L J. Co-expression ofand glyphosate acetyl transferasegenes conferring high tolerance to glyphosate in soybean., 2015, 6: 847.

[20] Dun B Q, Wang X J, Lu W, Zhao Z L, Hou S N, Zhang B M, Li G Y, Evants T C, Xu M Q, Lin M. Reconstitution of glyphosate resistance from a split 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase gene in Escherichia coli and transgenic tobacco., 2007, 73: 7997–8000.

[21] Wang X J, Jin X, Dun B Q, Kong N, Jia S R, Tang Q L, Wang Z X. Gene-splitting technology: a novel approach for the containment of transgene flow in., 2014, 9: e99651.

[22] Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. Efficient transformation of rice (L.) mediated byand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA., 1994, 6: 271–282.

[23] 国际农业生物技术应用服务组织. 2016年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势. 中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 1–8 International Agricultural Biotechnology Application Service Organization (ISAAAA). Development trend of Biotechnology/ transgenic crops commercialization in 2016., 2017, 37(4): 1–8 (in Chinese with English abstract).

[24] Ge J, Wang L, Yang C, Ran L, Wen M, Fu X, Fan D. Intein mediated Cre protein assembly for transgene excision in hybrid progeny of transgenic., 2016, 35: 2045–2053.

Cultivation of herbicide tolerant transgenic rice by gene spliting technique

DONG Yu-Feng1, WANG Xu-Jing1, SONG Ya-Ya1, JIN Xi2,and WANG Zhi-Xing1,*

1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, MARA Key Laboratory on Safety Assessment (Molecular) of Agri-GMO, Beijing 100081, China;2Baoding Institute, Baoding 071000, Hebei, China

The environmental risk caused by gene flow from herbicide-tolerant rice to normal rice is focused by the public and has become a key factor affecting the use of herbicide-tolerant rice in rice production. Gene splitting technique can effectively resolve the problem of the environmental risk and be applied on the development of herbicide-tolerant rice. In this study, the herbicide-tolerant genewas separated into N-terminal (EPSPSn) and C-terminal (EPSPSc) and were fused withDnaE intein, N-terminal (Intein-N) and C-terminal (Intein-C), to form fusion genesand, respectively.andwere separately transferred into Zhonghua11 by-mediated method. Southern hybridization demonstrated that the transgenic lines En-12 and Ec-22 were integrated with a single copy of insertion. The flanking sequence analysis demonstrated that the foreign genes in the transgenic lines En-12 and Ec-22 were respectively inserted into chromosomes 2 and 6. The homozygous lines of En-12 and Ec-22 were screened using the optimized four-primer method, and the hybrid En×Ec containing bothandwas obtained through sexual hybridization. Glyphosate resistance analysis revealed that transgenic rice containing only one gene fragment did not possess glyphosate tolerance, while transgenic rice En×Ec containing both gene fragments showed glyphosate tolerance. The glyphosate tolerance of the hybrid En×Ec was slightly weaker than that of the transgenic lines containing whole, but could meet the requirement in rice production. The results of this study provide a scientific basis for the use of gene splitting technology to develop safe transgenic glyphosate-tolerant rice, and also a new technology platform for genetically engineering safe transgenic hybrid rice.

glyphosate-tolerance; transgenic rice; gene splitting

2018-05-24;

2018-12-24;

2019-01-04.

10.3724/SP.J.1006.2019.82029

王志兴, E-mail: wangcotton@126.com, 010-82106102

E-mail: yufengdong1989@126.com

本研究由国家公益性行业(农业)科研专项(201403075)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2016zx08010-003)资助。

This work was supported by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201403075) and the National Major Project for Developing New GM Crops (2016zx08010-003).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190102.1355.002.html