免疫相关副反应发病机制及预测因子的研究进展

范银星 柴荣 韩一平

海军军医大学附属长海医院呼吸与危重症科,上海 200433

免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICPis)近年来发展迅速,其中细胞毒T 淋巴细胞抗原4(cytotoxie T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1/配体1(programmable cell death protein 1/L1,PD-1/L1)抑制剂是最主要的2种[1]。多种肿瘤的临床研究结果证实,ICPis一旦产生应答,有实现肿瘤长期控制的可能[2-3],但伴发的免疫相关不良反应(immune-related adverse events,irAE)常成为ICPis应用的阻碍。因此,深入研究irAE发生的机制,发现具有早期预测作用的生物标记物对提高ICPis的有效性、安全性和耐受性具有重要意义。本文从irAE 的概况、irAE 的发生机制及预测irAE的标记物3个方面对irAE 研究进展进行综述。

1 irAE的概况

irAE是由免疫系统非特异性激活引起的,全身系统均可受累,大部分irAE 程度较轻且可逆,也有部分irAE 存在致命可能,ICPis治疗初始的6个月内是发生irAE 的高峰期[4-5],但治疗全程乃至治疗结束后均有发生irAE 的风险。Wang等[6]的meta分析显示,3 545例ICPis治疗患者的总体死亡率为0.6%,最主要的致死原因有结肠炎、神经毒性、肺炎、肝炎和心肌炎。不同ICPis的irAE 发病情况差异较大,通常CTLA-4抑制剂irAE发生率和严重程度均高于PD-1/L1抑制剂[7]。约90%CTLA-4治疗患者会发生不同程度的irAE,严重irAE 的发生率为10%～42%,PD-1/L1抑制剂irAE 总发生率约70%,11%～20%的患者表现较为严重[8]。对于ICPis联合治疗,严重irAE 的发生率明显增高[9]。目前,irAE的治疗多基于临床经验,多家权威肿瘤治疗机构已发布了irAE 的临床管控指南[10-11]。治疗根据不良反应通用术语标准分4个等级,轻度irAE 无需停药,仅需对症处理或口服小剂量激素;中重度irAE 治疗首先需停用ICPis,之后根据具体表现选择激素或免疫抑制剂等多种治疗方法。

2 irAE发生机制的研究进展

ICPis引发irAE的机制尚不清楚,现研究表明有多种机制参与其中,包括ICPis与非肿瘤组织上的靶分子结合诱导下游的免疫反应,新型T 细胞或耗竭T 细胞对非靶组织上有交叉反应的抗原再次激活,自身抗体以及炎性细胞因子的产生等。

2.1 非肿瘤组织表达ICPis识别的靶点 不同ICPis引发的irAE 表现出显著的器官特异性,CTLA-4抑制剂相关肠炎和垂体炎发生率比PD-1/L1抑制剂高6～9倍,而PD-1/L1抑制剂相关肺炎和甲状腺炎发生率比CTLA-4 抑制剂高6倍[12],这可能与不同组织表达免疫检查点组分的差异相关。Iwama等[13]研究发现,小鼠反复接受CTLA-4单抗注射后,垂体出现大量淋巴细胞浸润,外周血垂体抗体水平升高,在20例黑色素瘤患者中同样发现,采用Ipilimumab前所有患者外周血垂体抗体均为阴性,治疗后发生垂体炎的7例患者垂体抗体转为阳性,而未发生垂体炎的13例患者垂体抗体仍为阴性。该研究间接证实垂体组织细胞可能表达某种特异性抗原,被CTLA-4单抗激活的T 细胞识别后产生了垂体抗体,从而导致垂体炎。Caturegli等[14]的研究则直接证实垂体细胞中表达的CTLA-4抗原起到新抗原的作用,与外源性CTLA-4抗体结合引发免疫反应,破坏垂体实质导致垂体炎的发生。该研究组收集6 例接受过Ipilimumab治疗的患者尸检的垂体切片,通过免疫组织化学染色检测垂体前叶素、免疫细胞、免疫球蛋白、补体和CTLA-4抗原表达情况,结果发现发生严重垂体炎的患者CTLA-4抗原水平最高,且CTLA-4抗原的高表达与T 细胞浸润和IgG 依赖性补体结合以及吞噬作用呈正相关性。其他组织器官是否因表达类似ICPis可识别的靶点导致irAE,仍有待进一步研究证实。

2.2 ICPis诱发新抗原特异性T 细胞或先前休眠的抗原特异性T 细胞的重新激活 一项ICPis联用引发严重心肌炎的研究发现[15],炎性改变的心肌细胞中有大量CD4+、CD8+T 细胞浸润,而没有B细胞或自身抗体,且浸润心肌和肿瘤组织的T 细胞属于同一克隆,表明心肌和肿瘤组织表达的共同抗原可激活这种特异性T 细胞从而引发心肌炎。Shirali等[16]报道,6例有长期服用致肾炎风险药物病史的非小细胞肺癌患者,在采用Nivolumab一定疗程后均出现急性间质性肾炎。Koda等[17]也有类似的个案报道,两项研究的肾穿结果均发现肾小管间质中有大量CD4+T细胞浸润,由此认为,PD-1抑制剂可能重新激活了原本对致肾炎药物免疫耐受的效应性T 细胞的活性,使其产生特异性免疫反应引起肾功能损伤。以上研究中大部分患者停用致肾炎药后肾功能可部分自行恢复,亦证实了这种假说的合理性。

2.3 自身抗体的产生 Osorio等[18]研究发现,80%治疗前抗甲状腺抗体阳性的患者在pembrolizumab治疗过程中发生了自身免疫性甲状腺炎,表明PD-1抑制剂可增强先前存在的抗甲状腺抗体活性,这可能是甲状腺irAE的重要病因。另外,抗双链DNA 和抗核抗原抗体是自身免疫性疾病常见的致病性抗体,Fadel等[19]报道,采用Ipilimumab 2个疗程后出现了狼疮样肾小球肾炎的患者,外周血中检测出抗双链DNA 和抗核抗原抗体,这些自身抗体在停药3个月后自行转阴,患者的肾功能也逐步恢复正常,进一步表明自身抗体致irAE的可能。新近,Das等[20]研究发现,接受ICPis联合治疗的黑色素瘤患者外周血循环B 细胞总数显著少于单药治疗患者,但浆细胞比例显著升高。浆细胞是分泌介导固有免疫反应抗体的主要细胞,这可能是ICPis联合治疗irAE发生率高的原因之一。至今相关研究较少,但综上所见,自身抗体在irAE的发生过程中发挥了重要的作用。

2.4 细胞因子的产生 irAE 是一种自身免疫相关的炎症反应,细胞因子在其中发挥了重要的作用。IL-17主要由辅助性T 细胞17(T helper cell17,Th17)分泌,它是一种促炎细胞因子,已被证实在多种自身免疫疾病中发挥作用。CTLA-4抑制剂可激活多种T 细胞亚型,包括Th17,从而刺激IL-17分泌诱发自身免疫反应[21]。Tarhini等[22]报道,Ipilimumab治疗黑色素瘤并发肠炎的患者血中IL-17 显著升高。在CTLA-4 相关肠炎小鼠模型外周血中也观察到IL-17的升高[23],这些研究为IL-17阻滞剂治疗ICPis相关肠炎提供了一定的理论支持。但IL-17阻滞剂有减弱ICPis抗肿瘤作用的风险[24],也需引起足够的重视。也有其他细胞因子的相关研究,Johnson等[15]研究发现,ICPis相关心肌炎患者的心脏、骨骼肌和肿瘤细胞中,包括趋化因子配体10 在内的多种炎性因子的RNA 转录水平上调。Murakami等[25]报道,ICPis相关急性间质性肾炎患者血浆中促炎因子IL-1Ra、趋化因子配体10和肿瘤坏死因子均显著升高。不同的细胞因子在irAE的发生过程中具体起到何种作用还需要进一步深入研究。

irAE的发生主要与免疫功能紊乱相关,而其表现出的异质性,包括受累器官的广泛性,临床表现的多样性以及严重程度的差异性均提示以上的研究结果不能完全解释irAE的发生机制,未来需要更加全面深入的观察与研究。

3 irAE的预测标记物

随着irAE发病机制研究的深入,irAE 预测标记物的相关研究发展迅速,目前已发现肠道菌群、免疫细胞浸润、基因突变多态性、自身抗原抗体以及某些炎性因子具有一定的预测价值。

3.1 肠道菌群成分的改变 人体肠道内大约寄生着1 014个细菌,共有约300～1 000个不同种类,统称为肠道共生菌群,这些菌群的基因总数是人体基因的100倍[26]。肠道菌群参与人体多种病理生理过程,在调节宿主免疫应答方面有重要的作用[27]。肠道菌群对ICPis治疗有效性和毒性反应的影响近年来受到极大的关注。Vétizou 等[28]发现,肠道无菌的MCA205肉瘤小鼠经强饲脆弱拟杆菌和洋葱伯克霍尔德氏菌后腹腔注射CTLA-4单抗,20 d后小鼠结肠黏膜微损伤程度明显轻于未强饲细菌的小鼠。这种保护作用被认为与脆弱拟杆菌调动树突状细胞,促进黏膜上的可诱导共刺激分子表达的调节性T 细胞(regulatory T cells,Tregs)增殖有关[29]。Sivan等[30]报道,通过给小鼠强饲或粪菌移植双歧杆菌,可明显增强PD-1/L1抑制剂控制肿瘤生长的作用,并减轻细胞毒性T 淋巴细胞介导的免疫反应,机制研究发现双歧杆菌处理后的小鼠肿瘤微环境中浸润了大量CD8+T 细胞和肿瘤特异性T 细胞,提示双歧杆菌是以非抗原依赖性方式改善小鼠抗肿瘤免疫功能。

来自人群的相关研究证实了肠道菌群的作用。Routy等[31]发现,在ICPis治疗前或治疗初始应用广谱抗生素与未用抗生素的患者相比,疾病无进展时间(3.5月比4.1月,P=0.017)和总生存期(11.5月比20.6月,P＜0.001)均显著缩短,这种负性作用可能与广谱抗生素破坏肠道菌群组成相关。Dubin等[32]报道,Ipilimumab治疗的黑色素瘤患者中,拟杆菌门细菌比例高的患者发生肠炎的风险显著降低,机制研究发现,缺乏细菌多胺转运和B组维生素合成的遗传途径与结肠炎风险增加相关。Chaput和Frankel等[33-34]均发现,Ipilimumab治疗的患者粪菌类群中,厚壁菌门的瘤胃菌科(如普拉梭菌)的丰度较高而拟杆菌门丰度低的患者发生结肠炎的风险更高。以上研究均证实肠道菌群对ICPis治疗存在重要的影响,检测肠道菌群的组成是预测ICPis 有效性和irAE 发生风险的潜在方法。16sRNA 测序平台是常用的检测细菌种类的方法,但由于平台及患者个体差异较大,目前不能明确具有改善预后作用的菌群,但通过服用或粪菌移植具有改善预后作用的菌群提高ICPis治疗的有效性,降低irAE 的发生率,将是未来研究的重要方向。

3.2 外周血和肿瘤微环境中不同亚型的免疫细胞浸润 目前关于Tregs、嗜酸粒细胞和B细胞的研究较多。Tregs是效应性T 细胞的负性调节细胞,生理情况下主要参与维持免疫耐受和免疫稳态。肿瘤浸润性Tregs可以上调肿瘤微环境中PDL-1、PDL-2、IL-1R2和趋化因子受体8 等负性免疫检查点的表达,帮助肿瘤细胞免疫逃逸。研究表明,CTLA-4单抗发挥抗肿瘤活性的重要途径之一就是选择性减少瘤内Tregs[35],同时,也是导致自身免疫易感性的增加的原因[36]。Liu等[37]报道,Tregs的消耗可能是受累器官中效应性T 细胞增加和血液中干扰素-γ及肿瘤坏死因子水平升高介导的。另外,Tregs在肠道免疫耐受中也有重要的作用,已经发现一些肠道共生菌如普拉梭菌可增加Tregs水平,这可能是肠道某些共生菌群导致肠炎风险增高的机制之一[33]。

关于嗜酸粒细胞,Jaber等[38]报道,抗CTLA-4 治疗发生皮肤irAE的患者外周血和受累皮肤中嗜酸粒细胞显著增加。虽然PD-1/L1抑制剂治疗尚未发现类似的关联[39],但在对ICPis联合治疗导致的皮肤红斑病理活检时发现不同程度的嗜酸粒细胞的浸润[40],均提示嗜酸粒细胞有作为潜在预测因子的可能。

B细胞也在irAE中发挥了作用,Das等[20]发现,ICPis联合治疗早期,外周血B细胞的变化与3/4级irAE显著相关,发生3/4级irAE患者的B细胞总数下降,但记忆性B 细胞亚型CD21lowB 细胞和浆细胞比例上升,CD21lowB细胞表面淋巴组织归巢相关因子CXCR4 和CXCR5表达水平较低,表明CD21lowB 细胞向非淋巴组织浸润的能力较强,可能有助于介导的炎症发生。因此,外周血B细胞计数和B 细胞亚型分析有预测irAE 发生的潜在价值。检测免疫细胞预测irAE仍处于初始阶段,但新型流式细胞分析平台可以以生物学相关行为定义免疫细胞亚群,为明确具有预测价值的免疫细胞亚型提供了可能[41]。

3.3 基因多态性 CTLA-4和PD1/PD-L1通路在抑制自身反应性T 细胞活性和维持机体免疫耐受中起关键作用,CTLA-4基因功能性突变很常见,这是宿主维持对病毒或胞内感染抵抗性的重要机制[42]。有研究发现,CTLA-4和PD1/PD-L1的这种基因多态性与多种自身免疫疾病相关[43-44]。而irAE与自身免疫性疾病有很多相似的临床表现,可见CTLA4和PD1/PDL-1通路以及其他免疫调节途径的基因变异对irAE 的易感性有潜在的预测作用。Patil等[45]对ICPis治疗的黑色素瘤患者的肿瘤样本进行全外显子测序,发现了14 个突变基因在发生结肠炎的患者中富集。基因组全外显子测序检测肿瘤突变负荷已被证实有预测ICPis有效性的作用[46],类似的方法是否可预测irAE仍需深入研究。

3.4 自身抗原抗体 在ICPis治疗过程中监测某些自身特异性抗原抗体的变化可能是预测irAE 的有效方法。Kobayashi等[47]研究证实,在Nivolumab治疗开始后的24周内,甲状腺irAE在抗甲状腺抗体阳性组(3/6)的发生率显著高于抗体阴性组(1/60)(P＜0.001)。一项Ipilimumab联合卡介苗治疗转移性黑色素瘤的1期临床试验发现[48],2例发生严重irAE的患者外周血中自身抗体水平显著升高,而且这些自身抗体在irAE出现之前即已被检测到,表明动态监测自身抗体谱可能是预测irAE 的方法。目前蛋白质微阵列技术可同时检测针对大量靶标的特异性抗体,应用这种技术对比发生和未发生irAE患者循环自身抗体的差别和治疗过程中自身抗体水平的变化,可从中筛选潜在的预测irAE标记物。

3.5 免疫细胞释放的细胞因子 IL-17在肠道irAE发生过程中起到了重要的作用[22-23],Tarhini等[49]研究发现,如IL-17基线水平较高,则Ipilimumab治疗引发3～4级结肠炎的风险增加,表明IL-17 有肠道irAE 预测价值。Fujimura等[50]对Th17另一个标记物趋化因子配体5和肿瘤相关巨噬细胞标记物可溶性CD163 的研究发现,发生irAE的患者组血浆可溶性CD163和CXCL5较基线显著升高,提示可溶性CD163和趋化因子配体5可能有预测irAE的作用。Matsuo等[51]评估PD-1抑制剂应用前后外周血中88种可溶性免疫介质水平的变化与预后和irAE 的相关性发现,治疗前后外周血CXCL2水平下降和基质金属蛋白酶2水平上升的患者无进展时间和总生存期显著延长,而irAE发生率也相对较高。以上研究提示细胞因子与irAE的发生存在密切的关系,但距离应用于预测irAE的发生还有很长的路要走。

4 展望

ICPis的临床应用发展迅速,不同ICPis的联合,与化疗、放疗、靶向药物、血管内皮抑制剂等其他治疗方法的联合以及可手术患者的早期辅助治疗的临床试验正如火如荼的开展,ICPis未来必将全面改变多种肿瘤的治疗策略。irAE无疑是拓展ICPis应用的阻碍,目前我们对irAE的研究尚浅,但最新的DNA、RNA、蛋白质组学检测技术可以帮助我们逐步了解irAE 发生的机制,发现预测irAE 的标记物,筛选出irAE 发生风险较高的患者,最终达到提高ICPis治疗的安全性与有效性的目的。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突