Toll样受体9在急性心肌梗死血管新生中的作用机制

根据2017年中国心血管病报告，我国2002年至2015年急性心肌梗死(AMI)死亡率逐年上升，疾病负担较重[1]。心肌梗死是引起心力衰竭的主要原因之一。心肌梗死后心肌细胞缺血损伤，导致心肌肥大，心肌纤维化，进而发生广泛的心肌重构，心功能逐渐恶化并最终发展为心力衰竭。器官在缺血后会出现大量凋亡细胞，使机体产生一系列免疫反应，如宿主防御和损伤修复反应。由Toll样受体(TLR)介导的天然免疫和炎性反应在缺血损伤中起重要作用[2]。TLR9作为模式识别受体，在识别微生物相关分子模式和促免疫反应中发挥重要作用。大量研究发现TLR9与高血压[3]、缺血性心脏病[4-6]、心力衰竭[7-8]等心血管疾病密切相关。心肌梗死后心肌毛细血管密度不足可影响心肌梗死后修复和心肌重构过程[9]。了解血管新生的潜在机制对于识别调控血管新生的治疗靶点非常重要。本文概述TLR9在心血管疾病中的作用，重点介绍TLR9在AMI血管新生中的分子作用机制。

1 TLR9简介

TLR家族是模式识别受体(PRR)，现已在哺乳动物中鉴定出13种TLR，TLR1～TLR9存在于人和小鼠体内，TLR10仅存在于人体内，TLR11～13仅存在于小鼠体内。作为Ⅰ型跨膜蛋白，TLR主要由胞外富含亮氨酸重复序列(LRR)识别并作用于相应配体[10]。不同TLR可对具有不同结构的配体进行单独或协同识别，激活胞内信号转导通路，进而激活特异性的免疫应答。

TLR9是一种能识别胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序(CpG DNA)的TLR，它由非甲基化CpG DNA重复序列激活，并在心肌细胞和心脏成纤维细胞中表达。TLR9的内源性配体包括线粒体DNA(mtDNA)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。人类mtDNA在化学构成上仍保留着原核细菌的特性，即CpG不被甲基化修饰[11]，因此TLR9也可识别人类mtDNA进而发挥作用。Zhang等[12]研究发现，mtDNA能像CpG一样作用于树突状细胞的TLR9，进而激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和核因子κB(NF-κB)信号通路，诱导细胞的固有免疫应答。HMGB1是一种普遍存在于转录调控、DNA复制修复和核小体组装过程中的核蛋白。当细胞在创伤或感染后死亡时，HMGB1被释放到细胞外环境中，激活天然和适应性免疫，最终促进组织修复[13]。HMGB1通过协调巨噬细胞向组织愈合表型的转换、促进干细胞激活和增殖以及促进新生血管生成，参与组织修复和愈合[14]。近期研究表明，HMGB1在癌症[15-16]、组织修复[17]和缺血性脑卒中[18]的血管新生中起着核心作用。以上研究提示，TLR9可能通过与mtDNA和HMGB1相互作用在心血管疾病中发挥重要作用。

2 血管新生与AMI

血管新生是指自体血管通过出芽或分支生长新血管的过程，包括细胞黏附，基底膜降解，细胞迁移、增殖及分化，该过程对组织生长及损伤修复都起着重要作用。在AMI的病理过程中，促血管新生和抑制炎性反应的因子增多可以促进缺血后的心脏修复[19]。组织的生理功能依赖于血管提供足够的营养和氧气。为了满足心肌细胞的高代谢需求和氧气需求，机体必须向心肌细胞提供有效的血液供应。心肌梗死后心肌细胞缺氧坏死，进而出现心肌细胞肥大和收缩力减弱，最终发展为心力衰竭，新生血管增多可重新恢复心肌细胞氧供。

在众多的血管生长因子中，血管内皮生长因子(VEGF)在生理及病理学中发挥核心作用。VEGF是一种特异性肝素结合生长因子，以内皮细胞作为特异性靶细胞，是内皮细胞促有丝分裂剂。在转录过程中，由于mRNA不同的剪切方式，VEGF形成6种异构体，包括VEGF-A～VEGF-F，其中VEGF-A与VEGF受体(VEGFR)2结合后主要介导组织血管的形成。AMI后，VEGF及其受体的表达上调，导致新生血管和侧支循环增多。AMI患者入院时血清VEGF即出现升高，入院第14天达到高峰，随后逐渐降低[20]。

组织缺血缺氧可诱导低氧诱导因子(HIF)的产生。HIF是由HIFα和HIFβ组成的异二聚体，是包括VEGF在内的很多下游基因的转录激活因子，参与氧稳态调节、血管生成、细胞增殖和存活[21]。HIF-1由氧调节的HIF-1α和组成性表达的HIF-1β组成。在低氧情况下，HIF-1α与HIF-1β结合后形成有活性的HIF-1，HIF-1能够与VEGF的缺氧反应元件(HRE)结合，从而激活VEGF-A/VEGFR2信号通路。VEGFR2通过下游Janus激酶2(JAK2)和磷脂酶Cγ1(PLCγ1) 信号转导途径调节血管内皮细胞的增殖，通过类固醇受体共激活因子(Src)和黏着斑激酶(FAK)信号转导途径调节血管内皮细胞的迁移，还通过JAK2、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)信号转导途径调节内皮细胞的凋亡[22]。研究发现，HIF-1α不仅在血管新生时发挥作用，在血管形成的后期还可调控血管平滑肌细胞和周细胞对血管内皮细胞的覆盖，诱导动脉生成[23-25]。

3 TLR9在AMI血管新生中的作用

缺血性心脏病发生后，TLR启动免疫应答，并在组织修复期间调节VEGF介导的血管生成。TLR信号以两种不同的方式触发血管生成。在巨噬细胞中，TLR的激活可以促进VEGF的表达和分泌，从而诱导内皮细胞迁移和血管生成[26]。在内皮细胞中，TLR的激活可以刺激VEGF的表达，促进细胞增殖、迁移和管腔形成[27]。

在损伤修复时，炎性反应早期各种细胞、细胞因子和细胞外基质成分的释放可促进血管生成并建立炎性反应诱导的血管生成系统，新生血管又可增加炎性细胞的聚集，从而形成良性循环[3]。Omiya等[6]研究证实，TLR9介导的信号通路对AMI后早期心脏破裂具有保护作用，而炎性反应并未参与TLR9在梗死心脏中的保护作用。

有越来越多的研究关注TLR9和血管新生在心血管疾病中的作用。Hilbert等[28]确认了一组对促进TLR9预处理小鼠血管新生有特异性作用的基因，如S100A9、S100A8、ARG1、CFB和CCL2，在TLR9预处理小鼠中，这些基因显著上调。研究发现，在自发性高血压大鼠中，mtDNA和脱氧核糖核酸酶活性受损可能通过TLR9激活天然免疫系统，并可能导致动脉压升高和血管功能障碍[3]。Zhou等[5]研究发现，TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)预处理对体内外血管生成有显著促进作用，并在缺氧和缺血条件下显著促进AMI后的心功能。

另外，TLR9还可能通过HMGB1影响血管新生。HMGB1是血管生成的有效诱导因子，并可由HIF-1α激活[29]。HMGB1通过激活整合素招募内皮祖细胞，诱导内皮细胞迅速迁移和增殖，在缺血区域的新生血管形成中发挥重要作用。研究发现，坏死细胞主动释放的HMGB1可依赖TLR激活NF-κB，促进血管生成因子如VEGF在造血细胞和内皮细胞中的表达，其后通过调节内皮渗透性和血管生长促进血管新生[30- 31]。上述研究表明，TLR9参与血管新生并影响缺血性心肌病的发生发展。

4 展望

临床研究中，增加心肌局部生长因子的浓度对于缓解心肌缺血是可行的。在缺血心肌组织中建立大量的侧支循环，可通过增加微血管密度，使冠状动脉血流量增多，梗死面积减小，心功能改善，心室重构和心力衰竭得以预防。通过TLR9调控免疫反应，可作为心肌梗死或其他损伤后组织修复的干预治疗措施。TLR9配体CpG-ODN在人体内可激发天然免疫反应，不伴有明显的副作用[32]。近期研究表明，CpG-ODN在肿瘤治疗、疫苗佐剂等方面具有良好的临床应用价值，将TLR9作为治疗靶点对于心肌缺血和其他疾病有较好的应用前景。早期采取措施恢复缺血区心肌组织血流供应是降低病死率的关键，可以利用特定的CpG片段来激活TLR9，从而通过血管新生来调控心肌梗死的发展。TLR9在细胞中的运输及TLR9下游的信号转导机制尚不明确。TLR9在改善心肌缺血损伤的过程中究竟以何种方式减少心肌损伤，其促进血管新生的作用是一种病理生理结果还是作为缺血后的代偿反应，亦或是参与了组织修复，也未明确，这些都有待进一步阐明。