结直肠癌发病相关的lncRNA筛选及GAPLINC对HCT116细胞的作用

罗育其 温敏杰 于海涛

广州市第一人民医院南沙医院普通外科（广州511457）

CRC患者的临床表现缺少特异性，主要表现为腹痛、便血和大便习惯改变，其确诊有赖于肠镜检查［1］，但目前CRC的早期诊断率低，影响其治疗效果。lncRNA在表观遗传水平、转录水平和转录后水平上对基因的表达进行调控，具有重要的生物学意义，其异常表达往往与肿瘤的发生发展有关［2-3］。PCR基因芯片技术可实现对基因表达差异的高通量筛选，具有灵敏、可靠的特点，是研究肿瘤基因表达异常的有效工具［4］。因此，本研究拟根据文献报道，通过lncRNA PCR芯片筛选CRC相关差异性表达的lncRNA，并挑选差异表达较明显的lncRNA进行大样本的临床标本及功能验证。

1 材料与方法

1.1 临床标本准备

3对lncRNA PCR筛选标本和21例CRC组织标本均取自于2011年7月—2015年9月广州市第一人民医院普通外科患者手术标本，肿瘤组织取自非中央坏死部分，正常结直肠黏膜组织取自于距肿瘤边缘5 cm以上，标本-80℃低温保存。

1.2 lncRNA PCR芯片实验

组织标本的总RNA提取采用Trizol法，试剂盒购于Invitrogen公司，相关操作按试剂盒说明书进行。提取的总RNA的浓度和纯度送往上海英拜科技生物有限公司进行质检。根据文献报道、Emsable数据库、Reseq和UCSC基因浏览器内的相关资源，确定84个于人类肿瘤发病相关的lncRNA制备成lncRNA PCR芯片（由上海英拜生物科技有限公司合成）。将提取的RNA反转录为cDNA，所用的试剂盒为RT2 First Strand Kit（330401，Qiagen，Hilden，Germany），然后将cDNA溶于100μL的双蒸水中，在lncRNA PCR芯片上每孔滴加1μL的cDNA溶液进行实时定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测，lncRNA PCR芯片上每个微孔中含有不同目的基因的引物，RT-qPCR反应采用RT2 SYBR Green Mastermix试剂盒（Qiagen，330401），所有操作均按试剂盒说明书进行，PCR的反应条件为：95℃，聚合酶激活/变性10min；95℃，15s扩增，60°C，1min收集荧光（40循环）。根据肿瘤标本和正常对照标本Ct值比较得出基因表达的差异。

1.3 21对临床标本验证GAPLINC的表达差异

经lncRNA芯片实验确定候选研究lncRNA GAPLINC后，在21对临床标本中利用RT-qPCR进一步验证其表达差异。总RNA的提取和反转录为cDNA的方法与上一步骤相同。通过Primer6软件设计引物，GAPLINC引物序列为：GAPLINC-F5'-GCTTCTCTGCGTTCACACAC-3'；GAPLINC-R5'-TTCACAGAACTGCATACACATCA-3'，由上海生工生物工程公司合成。RT-qPCR的的参数为：95℃，聚合酶激活/变性10min；95℃，15s扩增，60°C，1min收集荧光（40循环）。所得的Ct值除以内参基因GAPDH的Ct值，得到校正后的表达量。

1.4 HCT116细胞培养

实验所需的CRC细胞株HCT116购自于中科院上海细胞库，细胞置于含10%胎牛血清RPMI 1640培养基中，5%CO2和95%空气培养箱中培养；恒温37℃，湿度95%，培养瓶细胞生长融合75%～85%时传代，每天观察一次，隔天换液。

1.5 GAPLINC表达质粒和siRNA细胞转染

克隆GAPLINC全长序列到pcDNA3.0载体，由上海英拜生物科技有限公司完成；由上海吉码生物科技有限公司合成GAPLINC小干扰RNA（siRNA）。利用Lipofectamine™2000试剂盒进行细胞转染，转染siRNA前一天将细胞铺至六孔板中，每孔约2×105个细胞。24小时后，观察细胞密度达到80%～90%左右时，使用Lipofectamine™2000将目的siRNA及阴性对照siRNA转染进细胞中。用不含血清和抗生素的RMPI1640分别稀释Lipofectamine™2000、质粒和siRNA，常温孵育5min。将稀释好的质粒和siRNA和Lipofectamine™2000混匀，常温孵育20min。孵育好的混合物均匀滴加到孔板中。转染24～48 h后吸去培养基，用1×PBS洗三遍，彻底清除未转进细胞的质粒和siRNA，收获细胞，进行荧光定量PCR检测转染和沉默效率。

1.6 细胞迁移、侵袭（Transwell）实验

细胞迁移：实验前先将Transwell chamber（购于CORNING公司）放在37℃培养箱中温育，消化待测细胞，用PBS和无血清培养基先后洗一次，用无血清培养基重悬细胞，计数，调整浓度为2×105/mL。在下室（即24孔板底部）加入600～800μL含10%血清的培养基，上室加入100～150μL细胞悬液，放入培养箱。24 h后用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30min。取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μL结晶紫染液的孔中，室温染色15～30min。轻轻用1×PBS冲洗浸泡3次，每次5min，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。

细胞侵袭实验步骤同迁移实验，使用胶原包被好的chamber（transwell biocoat）。

1.7 细胞凋亡检测

将不同处理48 h后的各组细胞消化下来，使用预冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的细胞悬液。流式试管中加入100μL细胞悬液，按下表加入5μL Annexin V与5μL核酸染料PI：

表1 细胞凋亡实验处理

轻轻混匀，室温避光处放置15min。各试验管中分别加入1×Binding Buffer缓冲液400μL。1小时内上流式细胞仪检测。根据检测结果统计PI+Annexin-V+细胞占所有细胞的百分比。

1.8 统计方法

结果采用均数±标准差表示，全部数据采用SPSS19.0统计软件分析，多组间均数比较采用方差分析；两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA PCR芯片检测结果

为了筛选CRC相关的lncRNA，本研究选用3例临床样本，取肿瘤组织（T）和癌旁对照组织（N），利用人lncRNA PCR芯片进行检测。总共观察了肿瘤相关的84个基因，结果提示有21个lncRNA在肿瘤组织中低表达，3个lncRNA在肿瘤组织中高表达，60个lncRNA表达无差异（图1）。在这些差异性表达的lncRNA中，GAPLNC在肿瘤组织中表达量增加（倍增数＞3，P＜0.05），且各样本中表达量相对稳定，因此选择GAPLNC为候选lncRNA，进一步研究其在CRC中的发生发展机制。

图1 lncRNA芯片各基因表达的差异（A 84个lncRNA的表达情况；B lncRNA表达差异的可视化热图，红色表示表达增加，蓝色表示表达减少。）

2.2 21对临床配对标本验证GAPLNC表达情况

为了进一步验证GAPLNC在CRC组织与癌旁正常对照组织表达差异，本研究选用21对临床样本进行验证，结果提示GAPLNC在肿瘤组织中表达增加（t=3.56，P=0.0013，图2A）。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）评价正常组织和CRC组织的区分度，结果提示ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.893，P＜0.05，具有良好的敏感度和特异度（图2 B）。

图2 21对临床样本GAPLINC表达情况（A正常组织和肿瘤组织GAPLINC的表达差异；B GAPLINC的ROC曲线）

2.3 增加或抑制GAPLINC的表达对CRC细胞凋亡的影响

CRC细胞株HCT116转染GAPLINC表达质粒或siRNA后，RT-qPCR检测表明，GAPLINC在细胞内表达增高或降低（图3）；将pCDNA3.1-GAPLINC转染HCT116细胞，处理48 h后用流式细胞术检测细胞凋亡程度，结果提示细胞凋亡受到明显抑制，与对照组相比，细胞凋亡比例降低，有统计学意义（4.1±1.1%vs 12.37±2.08%，t=6.08，P=0.0037，图3）。GAPLINC siRNA转染CRC细胞，RT-qPCR结果提示，siRNA抑制CAPLINC表达效果良好（图2）；siRNA转染细胞48 h后，与对照组比较，流式细胞术检测提示CRC细胞凋亡比例显著增加（31.13±5.60%vs 12.37±2.08%，t=5.443，P=0.0055，图3）。

图3 HCT116细胞转染GAPLINC表达质粒和si RNA后GAPLINC的表达情况

2.4 增加或抑制GAPLINC的表达对CRC细胞迁移及侵袭能力的影响

HCT116细胞转染GAPLINC表达质粒后，与对照组比较，其细胞迁移、侵袭能力增高（图5），有统计学意义（表2），GAPLINCsiRNA转染细胞，实验结果表明，抑制GAPLINC表达后，CRC细胞迁移、侵袭能力得到抑制（图5，表2）。

3 讨论

CRC的治疗取得了长足的进步，目前仍采用手术治疗为主的综合治疗，术后的肿瘤复发是影响治疗效果的一个主要因素。对于Ⅰ和Ⅱ期患者而言，其5年生存率可达到75%～95%，而Ⅲ期患者5年生存率只有30%～50%。因此，为进一步改善CRC患者治疗效果，实现CRC的早期诊断显得尤为重要。目前可用来筛查诊断CRC的手段有限，而国内50%的CRC患者均为Ⅱ期以上，使CRC的治疗效果大打折扣。因此，探寻CRC特异的分子标志物、影响CRC发生发展的相关分子用于早期诊断或靶向治疗具有重要意义［5］。

基因的表达在各个层次受到各种分子物质的调控，lncRNA因其长度大于200 nt，具有与编码RNA类似的结构，可与同源DNA（转录lncRNA的基因及序列相似的基因）序列结合、亦可与同源RNA序列结合、还因其可折叠成复杂的二级结构，可以蛋白质相互结合，在基因表达过程中起着重要作用［6-7］。目前已有大量的lncRNA被证实可能与CRC的发生发展有关，如HOXB-AS3、lncRNA-422、CLMAT3及LOC554202等［8-9］。本研究结合文献报道，选择84个与肿瘤发生发展密切相关的lncRNA，制备lncRNA PCR芯片，进行CRC发病相关的lncRNA筛选。芯片实验结果表明，CRC组织中存在大量的lncRNA表达异常，84个lncRNA中有24个lncRNA存在差异性表达，有统计学意义，其中21个表达下降，3个表达增加。lncRNA在CRC表达差异主要表现为表达量降低；这些表达下降的lncRNA多具有抑癌基因的功能，如PCAT29具有抑制细胞分裂的作用；TARID可使肿瘤抑制因子TCF21去甲基化而发挥抑癌作用［8］

图4 HCT116细胞转染GAPLINC表达质粒后siRNA后细胞凋亡改变

图5 HCT116细胞转染GAPLINC表达质粒及siRNA后细胞迁移、侵袭能力的改变（HE染色，×400；A细胞迁移情况；B细胞侵袭情况）

表2 增加或抑制GAPLINC表达后HCT116细胞迁移和侵袭能力的改变

LncRNA PCR芯片筛选结果显示，GAPLINC在CRC组织表达稳定增高，被选定为下一步临床标本验证及功能实验的lncRNA。GAPLINC基因位于人类18号染色体短臂上，长924 bp，转录后RNA长度为643 nt［10］。研究表明，在常氧状态下，GAPLINC具有促进细胞生长及延缓死亡的作用，它还有助于细胞在缺氧状态下生存；Bcl-2/Bax比例是调节细胞凋亡的“分子开关”，GAPLINC通过结合miR-211抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达，而沉默GAPLINC则增加Bax的表达，减少Bcl-2的量，进而使Bcl-2/Bax比例降低，促进细胞凋亡进程［11-12］。因此，GAPLINC具有促进胃癌细胞的增殖和侵袭，与肿瘤的分期及患者的预后不良密切相关［13］。本研究通过lncRNA芯片实验确定候选研究lncRNA为GAPLINC后，对其差异性的表达进行了大样本的临床标本验证，结果与胃癌组织类似，在CRC组织中GAPLINC亦高表达，构建ROC曲线，其AUC为0.892，有统计学意义，表明GAPLINC对区分正常组织和CRC组织具有良好的特异度和敏感度，也可利用其对CRC的癌组织及癌旁正常对照组织进行区分。此外，本研究实验结果表明，转染GAPLINC表达质粒增加GAPLINC在CRC细胞内表达后，CRC细胞细胞凋亡比例下降；此外，GAPLINC过度表达后，CRC的迁移、侵袭能力增强；相反地，构建siRNA转染CRC细胞抑制GAPLINC的表达后，CRC细胞的细胞凋亡比例增加，细胞迁移及侵袭能力减弱，这表明GAPLINC在CRC中发挥着促癌作用。因此，GAPLINC在CRC发生发展过程中可能起着重要的作用，具有潜在的临床意义。