铝胁迫下柠檬酸对多年生黑麦草种子萌发和幼苗生理特性的影响

黄玉婷，王栋麟，张卫红，刘大林

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

铝在土壤中主要以氧化物或硅酸盐沉淀物等形式存在，对植物和环境无毒害作用，但当土壤变为酸性甚至pH<5时，结合态的铝变为离子态，对植物产生毒害[1]。而环境的破坏导致酸雨频繁发生，加剧土壤酸化程度，土壤中Al3+的释放量增多，严重影响草本植物的生长。研究表明，铝胁迫对植物农艺性状及抗氧化酶系统等均有抑制作用[2-3]。目前，植物耐铝机制研究已取得一定的进展，其中铝胁迫导致根系分泌大量有机酸，并与铝螯合，缓解了铝对植物根系的毒害作用，减少了根系对Al3+的吸收，其中柠檬酸与Al3+结合程度最高[4]，因而柠檬酸成为缓解植物铝毒的一个重要物质。黄凯丰等[5]研究表明，柠檬酸处理在一定程度上能缓解铝胁迫对苦荞造成的伤害。金婷婷等[6]对大豆的研究表明，添加一定浓度的柠檬酸能缓解铝胁迫对大豆的毒害作用。但关于铝胁迫下，添加柠檬酸对禾本科植物特别是黑麦草生长影响的研究较少。

多年生黑麦草(Loliumperenne)是我国南方应用广泛的禾本科牧草，具有抗性强、再生性强和不易倒伏等优点，还因其营养价值高、适口性好以及生物产量高等特点成为草食畜禽的优质青饲料[7]。此外，黑麦草对土壤中多种重金属有较强的富集能力[8]，而轻金属铝胁迫对黑麦草的影响研究较少。因此，研究不同浓度的柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草的种子萌发和幼苗生理特性的影响，以期为缓解酸性土壤中铝胁迫对植物的毒害作用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

多年生黑麦草品种维多利亚，购于河南世纪天缘生态科技有限公司；试验试剂为氯化铝(AlCl3)、柠檬酸(C6H8O7)、1/2Hoagland营养液。

1.2 试验方法

材料培养采用培养皿滤纸发芽法[9]。挑选形态饱满均匀的维多利亚种子，用0.2%次氯酸钠溶液消毒15 min，用蒸馏水反复冲洗4～5次，在水温为(25±2)℃条件下浸种30 min。设18个处理组，每个处理组重复3次：(1)不加铝不加柠檬酸(对照)，Al0N0(CK)；(2)加铝不加柠檬酸，铝的处理分别为250，500 mg/L，2个浓度等级，代号依次为Al250N0，Al500N0；(3)加柠檬酸不加铝，柠檬酸的处理 0.2，0.5，0.8，1.1，1.5 mmol/L，5个浓度等级，代号依次为Al0N0.2，Al0N0.5，Al0N0.8，Al0N1.1，Al0N1.5；(4)加铝加柠檬酸，代号依次为Al250N0.2、Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5、Al500N0.2、Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1、Al500N1.5。在培养皿(直径10 mm)底部放入双层滤纸，每个培养皿放60粒种子，分别加入处理液10 mL，每天补充等量蒸馏水。第5 d换培养皿，在新培养皿底部放入双层滤纸，将幼苗移栽进去，分别加入处理液10 mL，每天补充等量蒸馏水。

1.3 测定指标

1.3.1 生长指标 种子放入培养皿中发芽开始，每天定时观察种子发芽和幼苗生长的情况，并记录每天发芽的种子数(胚根长等于种子长度一半)，发芽率按第9 d计算。

发芽势(GP)=前4 d发芽种子总数/供试种子数×100%

发芽率(GR)=试验结束时(9 d)种子发芽总数/供试种子数×100%

发芽指数(GI)=ΣGt/Dt

式中：Gt为t日的发芽数，Dt为相应的试验天数。

株高的测定：种子放入培养皿中发芽开始，第10 d各个处理随机取5株完整的黑麦草，用直尺测定植株基部到顶部的距离作为株高，每个处理3次重复。

根长的测定：种子放入培养皿中发芽开始，第10 d各个处理随机取5株完整的黑麦草，用直尺测定胚轴与根之间的过渡点开始到根末端的长度，每个处理3次重复。

1.3.2 生理指标 种子放入培养皿培养10 d后分别测定叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性、叶片丙二醛(MDA)含量和叶片相对电导率。SOD活性测定采用比色法[10]；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[10]；叶片相对电导率采用浸泡法[11]，用DDS-11A型电导率仪测定。

1.4 数据处理

用Excel 2016输入数据并计算基础数据，然后用SPSS 18.0进行Duncan法单因素方差分析和多重比较，最后用Excel 2016进行作图。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草的生长特性

2.1.1 种子萌发 与无柠檬酸处理相比，不进行铝处理以及500 mg/L的铝浓度处理下，柠檬酸处理对黑麦草的发芽势、发芽率及发芽指数无显著(P<0.05)影响，甚至还有抑制作用；250 mg/L的铝浓度处理下，Al250N0.8处理组提高了黑麦草种子发芽势、发芽率及发芽指数，分别为83.89%，91.11%和63.10%。但差异不显著(P<0.05)。柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草种子萌发并无显著(P<0.05)促进作用(表1)。

表1 不同浓度柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草种子萌发的影响

注：不同小写字母表示该品种在相同浓度Al3+、不同浓度柠檬酸处理间差异显著(P<0.05)，下同

2.1.2 幼苗根长和株高 与无柠檬酸处理相比，单柠檬酸处理对黑麦草幼苗地下部分生长无明显效应(P<0.05)；250 mg/L的铝浓度处理下，添加柠檬酸提高了黑麦草幼苗的根长，其中，Al250N0.8处理能显著(P<0.05)促进其根长；500 mg/L的铝浓度处理下，添加不同浓度的柠檬酸均能促进黑麦草幼苗的根长，其中Al500N0.8和Al500N1.1处理能显著(P<0.05)促进其根长，且2种铝浓度处理下根长随着柠檬酸浓度的升高先升后降。可见柠檬酸处理对铝胁迫下多年生黑麦草幼苗的根长具有显著促进作用。

与无柠檬酸处理相比，单柠檬酸处理对黑麦草幼苗地上部分的生长没有显著(P<0.05)影响；250、500 mg/L的铝浓度处理下，柠檬酸处理能提高黑麦草幼苗的株高，但差异不显著(P<0.05)。可见柠檬酸处理在一定程度上能缓解铝胁迫对多年生黑麦草幼苗地上部分生长的抑制作用(图1，2)。

图1 不同浓度柠檬酸处理的铝胁迫下多年生黑麦草幼苗的根长Fig.1 Effects of different concentrations of citric acid on root length of seedling under aluminum stress

图2 不同浓度柠檬酸处理的铝胁迫下多年生黑麦草幼苗的株高Fig.2 Effects of different concentrations of citric acid on plant height of seedling under aluminum stress

2.2 柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片生理特性的影响

2.2.1 叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性 与无柠檬酸处理相比，不进行铝处理以及250 mg/L的铝浓度处理下，柠檬酸处理提高了黑麦草幼苗叶片SOD活性，但差异不显著(P<0.05)；500 mg/L的铝浓度处理下，柠檬酸处理提高了黑麦草幼苗叶片SOD活性，其中Al500N0.2和Al500N1.1处理SOD活性显著(P<0.05)高于CK。由此可见，柠檬酸处理能提高铝胁迫下黑麦草幼苗叶片SOD活性(图3)。

图3 不同浓度柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片SOD的活性Fig.3 Effects of different concentrations of citric acid on SOD activity in leaf of seedling under aluminum stress

2.2.2 叶片丙二醛(MDA)含量 与无柠檬酸处理相比，不进行铝处理以及250、500 mg/L的铝胁迫下，添加柠檬酸后，黑麦草幼苗叶片MDA含量有所降低，且随着柠檬酸浓度升高，MDA含量呈现先降后升的趋势。其中250 mg/L的铝浓度处理下，5个柠檬酸浓度处理组MDA含量均显著(P<0.05)降低，Al250N1.1处理下MDA含量达到最低值。可见柠檬酸处理降低了黑麦草幼苗叶片的MDA含量(图4)。

2.2.3 叶片相对电导率 与无柠檬酸处理相比，单一柠檬酸处理均能降低黑麦草幼苗叶片相对电导率，其中Al0N0.5处理下相对电导率最低；250 mg/L的铝浓度处理下，Al250N0.5、Al250N0.8、Al250N1.1、Al250N1.5处理能降低黑麦草幼苗叶片相对电导率，其中Al250N0.8处理组的相对电导率最低；500 mg/L的铝浓度处理下，Al500N0.5、Al500N0.8、Al500N1.1处理均能降低黑麦草幼苗叶片相对电导率，其中Al500N0.8处理组的相对电导率最低；但各处理均不显著(P<0.05)。由此可知添加柠檬酸能降低黑麦草幼苗叶片相对电导率(图5)。

图4 不同浓度柠檬酸处理的铝胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片的MDA含量Fig.4 Effects of different concentrations of citric acid on MDA content in leaf of seedling under aluminum stress

图5 不同浓度柠檬酸处理的铝胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片的相对电导率Fig.5 Effects of different concentrations of citric acid on relative conductivity in leaf of seedling under aluminum stress

3 讨论

柠檬酸具有调节pH值的作用，而pH值的改变能够破坏胚细胞的结构[12]，抑制酶活性。试验表明，柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草种子萌发(发芽势、发芽率及发芽指数)无显著(P>0.05)促进作用，该结果与于敏等[13]添加柠檬酸对水稻铜毒害的研究以及邢素芝等[14]添加柠檬酸对小白菜种子萌发的研究结果相似。其结果可能是由于种子内保护酶系统遭到破坏，其作用机理还有待进一步研究。

铝毒主要通过抑制主根和侧根的伸长进而影响植株生物量。铝在根尖细胞壁上的积累是铝对植物根尖产生铝毒的先决条件，是植物铝毒敏感的主要特征，Al3+能通过离子交换的形式结合到细胞壁[15]，迫使K+外流[16]，导致细胞壁变薄。初晓辉等[17]对多花黑麦草的研究表明高浓度铝胁迫下，多花黑麦草的根长显著下降(P<0.05)。试验中铝胁迫均不同程度地抑制了多年生黑麦草幼苗根系的生长，添加柠檬酸后幼苗根系显著增长(P<0.05)，因此，添加外源柠檬酸对铝胁迫下多年生黑麦草幼苗的根长具有促进作用，该结果与徐芬芬[18]对大豆的研究结果相似。Al250N0.8，Al500N0.8和Al500N1.1处理组的缓解效果最为显著(P<0.05)，因此，不同浓度的铝胁迫下，缓解效果最佳的柠檬酸浓度基本一致。此外，铝毒也会抑制植物地上部分的生长，萧凤迴等[19]研究证明，铝胁迫下绿豆的株高降低，总生物量减少。试验中，柠檬酸处理在一定程度上增加了铝胁迫下幼苗的株高，孙远秀等[20]对西瓜幼苗的研究也获得类似的结果。但是，试验中柠檬酸对地上部分的缓解作用并不显著，可能是因为根系吸收的铝大部分残留在根系组织中，极少数运输至地上部分[21]，导致Al3+对地上部分的毒害较轻。有研究报道，柠檬酸处理对植物根系影响较大，而对地上部分影响较小，这可能是种子在萌发期间由胚乳提供能量，在胚乳的能量消耗完后幼苗开始由根部向外界汲取生长所需能量，当用柠檬酸处理时，根系首先受到影响且影响程度比其他部分更加显著[22]。

SOD是植物体内重要的抗氧化酶，它能维持活性氧的产生和清除平衡，保护植物细胞免受伤害，有研究报道低铝胁迫会刺激植物SOD活性升高[23]，但随着铝浓度升高，SOD活性下降[24]。陈佳等[25]对栝楼的研究发现，添加柠檬酸能明显缓解铝胁迫对栝楼叶片SOD活性的抑制作用，试验表明柠檬酸处理后，铝胁迫下黑麦草幼苗叶片SOD活性提高，不同柠檬酸浓度产生的效果有所差异，铝浓度越高，适宜的柠檬酸浓度越低，可能是植物受到铝胁迫时，根系自身会分泌柠檬酸所致，其原因还有待进一步研究。

MDA和相对电导率都是膜脂过氧化指标。MDA是膜脂过氧化的最终产物，大量积累会损伤质膜，使其选择透过性变差，导致细胞内电解质外渗，破坏相对稳定的细胞内环境[26]。曹林等[27]报道，铝胁迫导致菊芋MDA含量增加。而添加柠檬酸能降低叶片MDA含量[28]，修复植物细胞膜系统。相对电导率可反应细胞膜脂过氧化程度，是研究植物抗逆性的重要生理指标，铝胁迫导致细胞膜结构破坏、稳定性下降，透性增大[29]，最终迫使植物叶片相对电导率上升[30]。试验结果表明，柠檬酸能降低铝胁迫下多年生黑麦草幼苗叶片MDA含量和相对电导率，且随着柠檬酸浓度升高，MDA含量和相对电导率呈现先降后升的趋势。在铝浓度为250 mg/L时添加不同浓度的柠檬酸都能使MDA含量显著下降(P<0.05)，添加0.8 mmol/L柠檬酸能使相对电导率下降到最低，膜脂过氧化程度相对最轻。因此，柠檬酸处理能使铝胁迫下幼苗叶片细胞膜伤害的程度得到缓解。

4 结论

铝胁迫下，柠檬酸处理对多年生黑麦草种子萌发无促进作用，说明柠檬酸不能缓解铝胁迫对多年生黑麦草种子萌发的毒害作用。此外，通过对铝胁迫下多年生黑麦草幼苗在柠檬酸处理后的2个形态指标以及3个生理指标进行分析对比，得出添加柠檬酸能不同程度地缓解铝胁迫对多年生黑麦草幼苗的毒害作用，但不同浓度的铝毒作用下，不同浓度的柠檬酸对其生长的缓解效果不同。分析认为，柠檬酸浓度为0.8 mmol/L时对铝胁迫下多年生黑麦草品种维多利亚的生长最有益。因此，添加柠檬酸可以有效缓解酸性土壤中Al3+对多年生黑麦草的毒害作用。