饲用玉米根腐病病原鉴定及室内药剂筛选

陈应娥，梁巧兰，刘耀霞，王鑫伟，王兴铎，雷 雪，管亮亮

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

饲用玉米是一种优良的饲料作物，是重要的青贮饲料，对畜牧业的发展具有决定性的重要作用[1-2]。其鲜草叶片柔软、茎秆挺立、糖分含量高、生物产量高、适口性好、消化率高、饲用价值高，适于青贮或青贮饲用，适应种植范围广[3]。草产量可以达到1.5×105kg/hm2，发展饲用玉米生产，既可以调整种植业结构，避免种植结构单一，也可为当地的饲料加工企业提供原材料，为养殖企业提供优良的鲜草与青贮饲料，提高农民的收益，促进当地经济的发展[4]。随着甘肃省草牧业的发展和人民生活水平的提高，饲用玉米日益受到人们的重视，种植面积逐渐增加，但是连作造成玉米根腐病 (maize root rot)发生严重，病害发生后植株茎叶暗绿，病叶自叶尖向下或从边缘逐渐变黄干枯，须根初期表现为水渍、变黄，后腐烂坏死，造成幼苗枯死，严重影响玉米生产[5]。有关甘肃省饲用玉米根腐病研究尚未见报道。为此，试验对引起甘肃省饲用玉米根腐病的病原菌及其生物学特性和有效防治药剂进行了研究和筛选，以期对玉米根腐病的有效防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

玉米根腐病病样采自甘肃省古浪县发病的玉米田；供试培养基选用PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g)、玉米培养基(玉米300 g,琼脂16 g)、PSA培养基(马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂17 g)、胡萝卜培养基(胡萝卜200 g，糖20 g，琼脂15 g)[6]；试验仪器为超净工作台、灭菌锅、显微照相机、显微镜、恒温培养箱、电子天平等；供试药剂(表1)。

表1 供试药剂及推荐使用浓度

注：供试药剂8%恶霉灵为水剂，其他供试药剂都为可湿性粉剂，下同

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 在无菌条件下用剪刀在病健交界处剪1 mm×1 mm的方块，置于按表1配方制备灭菌的PDA培养基平板上，在25℃的恒温条件下培养，当培养出的菌落直径生长至1 cm时，用接种针挑取菌落边缘的菌丝置入另一皿PDA培养基内进行纯化培养，纯化后采用单孢分离法对分离菌进一步纯化，纯化后分离物移入试管斜面培养基中，待长出菌丝后，置于4℃冰箱保存备用[7-9]，并观察记录分离菌的培养形态。

1.2.2 分离物致病性测定 用打孔器打取在PDA培养基上培养4 d菌饼，接种到健康的玉米幼苗茎基部，以昆虫针刺伤玉米幼苗茎基部作“有伤接种”、以不刺伤作“无伤接种”，以接同样大小的PDA菌饼作对照，每处理3株幼苗，重复3次。置于相同条件下培养，逐日观察发病情况，判断被接菌种致病能力的大小，并从接种后发病的玉米苗上进行病原菌分离，进一步确定分离物是否为致病菌。

1.2.3 病原菌鉴定 将致病性测定中分离出的致病性明显病原菌在显微镜下观察并记录其菌落特征，菌丝、孢子形态等。依据文献[10-11]的方法鉴定病原物类型，并将病原物形态特征进行显微照相。

1.3 病原菌生物学特性测定

1.3.1 不同培养基对病原物的生长 从发病程度严重的玉米苗上分离出的病原菌置于25℃条件下培养4 d，再用d=5 mm的打孔器打取菌饼，分别接入按照上述配方配置并经高压灭菌的PDA培养基、胡萝卜培养基、玉米培养基、PSA培养基中央，每处理3次重复。25℃条件下置于恒温培养箱中，培养4 d后观察原物菌丝生长的状态及形态颜色，用十字交叉法测量菌落直径[12-13]，比较几种培养基对病原物菌丝生长的影响。

1.3.2 不同温度对病原物的生长 用打孔器于培养4 d的菌落边缘打取5 mm菌饼接种到灭菌的PDA平板上分别置于10、15、20、25、30、35℃条件下培养，每处理重复3次。4 d后采用十字交叉法测量菌落直径，比较不同温度对病原物菌丝生长的影响。

1.3.3 不同光照条件对病原物的生长 用打孔器取5 mm的菌饼接种到灭菌PDA平板上，分别放置于12 h光暗交替、24 h光照和24 h黑暗3种光照处理下，重复3次，4 d后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.4 病原菌室内药剂筛选及毒力测定

采用生长速率法[14]对主要致病菌进行室内药剂筛选。用无菌水将各药剂按表1中的浓度扩大50倍配制成药液，然后将药液按对半稀释法稀释成5个浓度，将配好的药剂吸取1 mL加入到49 mL灭菌冷却到45℃的PDA中，将其倒入灭菌后的4个培养皿上，制成含药培养基，并做好标记。将培养4 d后的病原菌用打孔器打取5 mm的菌饼，将菌饼接到含药PDA上，置于25℃的条件下培养，以加1 mL灭菌水的PDA培养基作为对照，每个处理重复4次，96 h后十字交叉法测量菌落直径，并计算抑菌率。

抑菌率(%)=

根据药剂浓度对数(横坐标)及对应的菌丝生长抑制率概率值(纵坐标)作回归分析，求出毒力回归方程y=a+bx，并计算出药剂抑制浓度(EC50)和相关系数，根据EC50评价杀菌剂毒力大小。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定

2.1.1 田间症状观察 调查发现，感病玉米叶片卷曲发黄，毛根减少，根尖变钝，植株萎蔫(图1)。

2.1.2 病原菌分离纯化 从玉米根腐病根部分离得到的真菌在PDA上的培养形态为菌丝稀疏突起羊毛状。菌落粉白色至肉色，由于大量孢子生成而呈粉质。大型分生孢子香肠形，顶细胞短、钝圆，少许有弯曲，通常3～4个隔膜或不清，大小为26.44～39.61 μm×4.17～5.92 μm ；小型分生孢子数量多,椭圆形和卵形，无分隔，大小为5.54～8.12 μm×2.32～3.87 μm(图2)。

2.1.3 分离物致病性测定及鉴定 将分离菌通过有伤和无伤接种到玉米茎基部后，发现玉米苗均有所感病，6 d时叶部逐渐变软、萎蔫、黄化，根系逐渐变褐，变软。15 d时观察发现有伤接种的苗子植株矮小甚至直接枯死，根部有腐烂，发病程度明显比无伤接种严重。同时从发病玉米茎基部均能分离到与接种菌在PDA上培养形态一致的病原菌。经培养形态观察和致病性测定，结合真菌鉴定手册将分离物鉴定为茄病镰刀菌(Fusariumsolani)。

图1 玉米根腐病田间症状Fig.1 Symptoms of maize root rot disease in field

图2 分离物培养形态及孢子形态Fig.2 Morphology and spore morphology of isolated fungi

2.2 茄病镰刀菌生物学特性研究

2.2.1 不同培养基对茄病镰刀菌生长的影响 通过不同培养基对病原菌的生长试验，结果表明茄病镰刀菌在PDA培养基上生长最好，其菌落平均直径达到80.67 mm，其次是PSA培养基，测得菌落平均直径75.83 mm。4种培养基培养的菌落直径之间差异极显著(P<0.01)(图3)。

图3 不同培养基处理下茄病镰刀菌的生长Fig.3 Effect of different media on the growth of Fusarium solani注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，下同

2.2.2 不同温度对茄病镰刀菌生长的影响 茄病镰刀菌在10～35℃均能生长，较适生长为25～30℃。其中，30℃条件下菌丝生长状况最好，菌落直径达到84 mm，25℃菌落直径为81 mm，15～30℃温度条件下菌落直径间差异极显著(P<0.01)，10℃和30℃下菌落直径间差异不显著(图4)。

图4 温度处理下茄病镰刀菌的生长Fig.4 Effect of temperature on the growth of Fusarium solani

2.2.3 不同光周期条件对茄病镰刀菌生长的影响 不同光周期条件对茄病镰刀菌的生长试验表明，光照对茄病镰刀菌菌丝生长的影响不大，培养4 d后菌落直径在12 h光暗交替条件下最大，为76.00 mm，24 h黑暗条件下菌落直径最小，为73.02 mm ，24 h全光照条件下的菌落直径介于二者之间，为74.00 mm，不同光照条件下12 h光暗交替和其他两个光照条件处理的菌落直径之间差异极显著(P<0.01)(图5)。

图5 光照处理下茄病镰刀菌的生长Fig.5 Effect of light on the growth of Fusarium solani

2.3 6种杀菌剂对茄病镰刀菌抑菌作用及毒力测定

6种药剂对茄病镰刀菌的抑制作用测定表明，8%恶霉灵对茄病镰刀菌的抑制效果最好，抑菌率为92.68%，其次抑菌效果较好的是80%多菌灵和75%百菌清，抑菌率分别为88.57%和85.33%，最差的是70%代森锰锌，其抑菌率仅为49.43%，6种杀菌剂对茄病镰刀菌的抑制率之间差异极显著 (表2)。毒力测定结果表明，8%恶霉灵毒力最大，EC50值为28.50 μg/mL，50%福美双剂毒力最小，EC50值为320.50 μg/mL，其他4种药剂的毒力介于二者之间(表3)。

3 讨论

20世纪90年代中期，玉米苗期病害在各玉米产区逐渐由次要病害上升为主要病害，重病地块病株率高达100%，严重时全田死苗，造成毁种，成为玉米生产上的新障碍。玉米苗期根腐病是玉米苗期的重要病害之一，可造成田间大量死苗，重病地块发病率达80%，且有逐年加重趋势，给玉米生产造成严重危胁[15-16]。国外报道引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola)、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)，主要病原菌为腐霉菌(Pythiumgraminicola)和镰刀菌(Fusariumgraminearum)，国内报道的病原菌串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、串珠镰刀菌胶孢变种(fusariummoniliformevar.subglutinans)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)、腐霉菌(Pythiumgraminicola)、丝核菌(Rhizoctonia)等[17-18]。玉米茎腐病、穗腐病和苗期根腐病是危害玉米的3种重要病害，过去一直进行单独研究。玉米苗期根腐病的研究相对较少，是由多种病原菌复合侵染引起。总之由于地理及气候条件的差异，各地区对于引起玉米根腐病的病原菌的说法各不一样，在我国南方比较潮湿的地区报道较多的是腐霉菌(Pythium)，而在北方较干旱地区多为镰刀菌(Fusarium)[19-20]。试验通过对甘肃省种植的饲用玉米根腐研究发现病原菌为茄病镰刀菌(Fusariumsolani)。生物学特性研究发现茄病镰刀菌的最适培养基为PDA，最适生长温度为30℃，光暗交替有利于该菌的生长；8%恶霉灵水剂、80%多菌灵可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂对茄病镰刀菌有较好的抑制效果，抑菌率分别为92.68%，88.57%和85.33%。EC50分别为28.50，45.50和97.50 μg/mL，可用于田间防治；有研究表明利用以化学农药为主要成分的武将450FS悬浮种衣剂、种子包衣剂处理种子可有效防治苗期根腐病[18,20-21]，木霉菌颗粒剂和种衣剂通过土壤穴施和种子包衣可有效防治玉米茎腐病和纹枯病，其中木霉菌颗粒剂防效达65%、87%[21]。而试验针对甘肃省饲用玉米根腐病病原菌仅分离得到一种强致病菌，对于是否存在其他病原菌、筛选的几种药剂的田间防效及其他种子包衣剂、生物农药的抑菌作用及防治效果等问题还有待进一步研究。

表2 6种杀菌剂对玉米根腐病菌的抑菌作用

注：同列不同小写字母表示差异显著(P≤0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P≤0.01)

表3 6种杀菌剂对茄病镰刀菌的毒力

4 结论

通过研究发现引起甘肃省古浪县饲用玉米根腐病的病原菌为茄病镰刀菌；该病原菌菌丝最适生长温度为30℃，最适培养基为PDA培养基，12 h光照、12 h黑暗交替有利于该菌的生长；6种杀菌剂对玉米根腐病均有抑菌效果，其中8%恶霉灵、80%多菌灵、75%百菌清抑制率均在85%，分别为92.68%，88.57%和85.33%。EC50分别为28.50，45.50和97.50 μg/mL；该试验结果对指导古浪县饲用玉米根腐病有效防治具有重要意义。